Preview

Вопросы вирусологии

Расширенный поиск

Биологическая характеристика и пермиссивность к вирусам штамма диплоидных клеток почки летучей мыши нетопыря Натузиуса (Pipistrellus nathusii Keyserling & Blasius, 1839; (Chiroptera: Microchiroptera: Vespertilionidae)

https://doi.org/10.36233/0507-4088-12

Полный текст:

Аннотация

Введение. Летучие мыши (Microchiroptera) являются эпидемиологически важным естественным резервуаром вирусов различных таксономических групп, включая возбудителей особо опасных болезней человека и животных. Учитывая актуальность арбовирусных инфекций, представляется целесообразным проведение исследований по изучению спектра чувствительности клеток из тканей летучих мышей, обитающих и мигрирующих на территории Российской Федерации, к вирусам векторных инфекций сельскохозяйственных животных.

Цель исследования - получение диплоидного штамма клеток почечной ткани летучей мыши (ПЛМ) вида нетопырь лесной, или нетопырь Натузиуса (Pipistrellus nathusii), изучение его биологических характеристик, а также оценка пермиссивности полученной клеточной культуры к вирусам блютанга, лихорадки долины Рифт (ЛДР), заразного узелкового дерматита (ЗУД) крупного рогатого скота (КРС), миксомы кроликов (Myxomatosis cuniculi), фибромы Шоупа, африканской чумы лошадей (АЧЛ) и африканской чумы свиней (АЧС).

Материал и методы. Донорами органов служили 2 особи клинически здоровых самцов летучей мыши Р. nathusii. Для получения диплоидного штамма культуры клеток почки этого вида и изучения свойств полученной клеточной культуры градации от 6-го и выше пассажных уровней использовали традиционные цитологические, вирусологические и молекулярные методы. Определяли пермиссивность данного штамма к вирусам блютанга, ЛДР, ЗУД, миксомы кроликов, фибромы Шоупа, АЧЛ и АЧС.

Результаты. Формирование конфлюэнтного монослоя наблюдали через 72 ч, при этом индекс пролиферации (ИП) был равен 2,7-3,3. Клеточный монослой сохранялся без смены среды в течение 45 сут (срок наблюдения). Показана стабильность кариотипа в условиях непрерывного субкультивирования на уровне 36-го пассажа. Культура клеток получила наименование «Штамм диплоидных клеток почки летучей мыши Pipistrellus nathusii (Diploid cell line Pipistrellus nathusii kidney)»; установлена её пермиссивность к вирусам блютанга, ЛДР, ЗУД и миксомы кроликов.

Обсуждение. Чувствительность полученного клеточного материала к вирусам блютанга и ЛДР согласуется с данными об идентификации реовируса и возбудителя ЛДР у египетских фруктовых летучих мышей (Rousettus aegyptiacus), а пермиссивность данного штамма к возбудителям ЗУД и миксомы кроликов - с результатами обнаружения поксвирусов у вида поздний кожан (Eptesicus fuscus).

Выводы. Получен и паспортизирован штамм диплоидных клеток ПЛМ P nathusii. Установленная пермиссивность к вирусам блютанга, ЛДР, ЗУД и миксомы кроликов позволяет использовать его для выделения и изучения этих патологических агентов. Репродукция возбудителей в клетках данного штамма из тканей ПЛМ вида P nathusii, обитающего и мигрирующего на территории европейской части Российской Федерации, указывает на его потенциальную роль в эпидемиологии значимых инфекций, особенно трансмиссивных.

Для цитирования:


Поволяева О.С., Юрков С.Г., Лаптева О.Г., Колбасова О.Л., Чадаева А.А., Кольцов А.Ю., Синдрякова И.П., Власов М.Е., Живодёров С.П., Луницин А.В. Биологическая характеристика и пермиссивность к вирусам штамма диплоидных клеток почки летучей мыши нетопыря Натузиуса (Pipistrellus nathusii Keyserling & Blasius, 1839; (Chiroptera: Microchiroptera: Vespertilionidae). Вопросы вирусологии. 2021;66(1):29-39. https://doi.org/10.36233/0507-4088-12

For citation:


Povolyaeva O.S., Yurkov S.G., Lapteva O.G., Kolbasova O.L., Chadaeva A.A., Kol'tsov А.Yu., Sindryakova I.P., Vlasov M.E., Zhivoderov S.P., Lunitsin A.V. Biological characteristics and permissiveness to viruses of diploid kidney cells strain from the bat Nathusius’ pipistrelle (Pipistrellus nathusii Keyserling & Blasius, 1839; Chiroptera: Microchiroptera: Vespertilionidae). Problems of Virology. 2021;66(1):29-39. (In Russ.) https://doi.org/10.36233/0507-4088-12

Введение

Возникновение и распространение новых вирусных заболеваний человека и животных интенсифицировало исследования в области поиска источников, переносчиков и резервуаров вирусов, а также эволюции и изменчивости этих патологических агентов, установления механизмов преодоления ими видовых барьеров. Рукокрылые (Chiroptera), насчитывающие свыше 1200 видов, являются вторым по величине отрядом млекопитающих [1], что наряду с высокой популяционной плотностью, широчайшим ареалом распространения, миграционной подвижностью и особенностями организации иммунной системы [2] позволяет рассматривать их как один из важнейших естественных резервуаров и источников распространения вирусных агентов [3–5]. Изоляция от летучих мышей (Microchiroptera) более 200 видов вирусов различных таксономических групп [6] подтвердила значение этих представителей рукокрылых как важнейшего звена эпидемического процесса при ряде особо опасных инфекционных болезней [7].

Установлено, что летучие мыши в большинстве биогеографических регионов, включая Западную Палеарктику, выступают естественным резервуаром для вирусов многих значимых семейств, таких как Rhabdoviridae [8, 9], Coronaviridae [10], Herpesviridae, Adenoviridae [11], Filoviridae [12], Reoviridae [13], Paramyxoviridae [14–16], Astroviridae и др. [17]. В то же время роль этих животных в эпидемиологии вирусных инфекций для Российской Федерации изучена недостаточно.

Следует отметить, что в подавляющем большинстве работ по идентификации вирусов летучих мышей основным инструментом исследований стали молекулярно-генетические методы, однако сам факт идентификации, в свою очередь, указывает также на высокий уровень пермиссивности клеток тканей данных представителей млекопитающих к вирусам различных таксономических групп.

Основной лабораторной моделью первичной изоляции вирусных патогенов являются культуры клеток. Тем не менее в случаях, когда в качестве источника инфекции рассматриваются летучие мыши, использование традиционных систем культивирования на клеточных культурах видов, не являющихся резервуарами, как правило, является малопригодным. По данным ряда исследователей, попытки выделить инфекционные агенты, переносимые летучими мышами, в различных линиях клеток млекопитающих в большинстве случаев не увенчались успехом [18].

Исследования по оценке чувствительности клеточного материала из тканей летучих мышей к патогенам немногочисленны и выполнены только для ряда видов, в основном связанных с возбудителями вирусных болезней человека [12]. Одной из первых клеточных культур, полученных из тканей летучих мышей, была культура клеток лёгкого вида Tadarida brasiliensis Tb 1 Lu (ATCC CCL-88), которая оказалась чувствительной к ретровирусу лейкоза КРС [19], вирусу энцефаломиокардита мышей, вирусу Эбола [20], возбудителям гриппа человека и птиц [21].

В связи со вспышками новых особо опасных болезней, ассоциированных с летучими мышами в качестве резервуаров возбудителей (Эбола, Хендра, Нипах, SARS, MERS, SARS-CoV-2), значительно расширились исследования по получению культур клеток из тканей различных видов представителей рукокрылых как для непосредственно вирусологических целей [22–25], так и для изучения иммунологических аспектов устойчивости этих млекопитающих к вирусным инфекциям и механизмов взаимодействия вирус–клетка [26, 27].

Кроме того, данные по чувствительности in vitro клеточных культур из тканей и органов летучих мышей могут быть экстраполированы на процессы оценки восприимчивости их хозяев к патогенам, исследование возможности вирусоносительства и участия данных животных в формировании природных инфекционных очагов [28]. Поэтому целью этой работы явились получение диплоидного штамма клеток почки летучей мыши (ПЛМ) – представителя семейства Vespertilionidae, вида Pipistrellus nathusii как многочисленного, широко распространённого в европейской части России, склонного к антропургической среде обитания, не находящегося в зоне риска и в то же время совершающего миграции, а также изучение пермиссивности полученной культуры к ряду вирусов – возбудителей инфекционных заболеваний животных.

Материал и методы

Животные. В экспериментах использованы летучие мыши вида нетопырь лесной, или нетопырь Натузиуса (Pipistrellus nathusii), отловленные при помощи туман-сети в Волгоградской области. В качестве доноров почек были отобраны 2 клинически здоровых самца с массой тела 10 и 12 г.

Культура клеток. Исследования выполняли с полученным нами диплоидным штаммом культуры клеток почки нетопыря лесного (Diploid cell line Pipistrellus nathusii kidney) градации 6-го и последующих пассажных уровней.

Вирусы. Определялась пермиссивность клеточной культуры к следующим вирусным агентам:

  • Вирус блютанга (семейство Reoviridae) 1-го серотипа 6-го пассажа в перевиваемой линии клеток почки африканской зелёной мартышки (Chlorocebus sabaeus) Vero с инфекционной активностью (ИА) 6,25 lg ТЦД50/мл (ТЦД – титр цитопатического действия, ЦПД).
  • Вирус лихорадки долины Рифт (ЛДР, семейство Phenuiviridae), штамм «1974-ВНИИВВиМ» на уровне 10-го пассажа в перевиваемой линии клеток почки сайги (Saiga tatarica) (ПС) с ИА 5,5 lg ТЦД50/мл.
  • Вирус заразного узелкового дерматита (ЗУД) крупного рогатого скота (КРС) (семейство Poxviridae) – полевой изолят, выделенный в очаге инфекции в Самарской области на уровне 5-го пассажа в первичной культуре клеток тестикул козлёнка (Capra hircus) (ТК), ИА 6,0 lg ТЦД50/мл.
  • Вирус африканской чумы лошадей (АЧЛ, семейство Reoviridae) 1-го серотипа на уровне 5-го пассажа в перевиваемой линии клеток почки африканской зелёной мартышки (CV-1) с ИА 5,75 lg ТЦД50/мл.
  • Вирус африканской чумы свиней (АЧС, семейство Asfarviridae), штамм «Волгоград» на уровне 4-го пассажа в культуре клеток костного мозга свиньи (Sus scrofa domesticus) с ИА 7,25 lg ГАЕ50/мл (ГАЕ – гемагглютинирующая единица).
  • Вирус фибромы Шоупа (семейство Poxviridae), патогенный для кроликов (Oryctolagus), выделен из патологического материала с ИА на кроликах на уровне 5-го пассажа 4,11 lg ИД50/мл (ИД – инфицирующая доза).
  • Вирус миксомы кроликов (семейство Poxviridae), штамм В-82 на уровне 3-го пассажа в перевиваемой линии клеток почки кролика RK-13/2-03, ИА – 6,5 lg ТЦД50/мл.

Используемые штаммы вирусов получали из Государственной коллекции микроорганизмов, вызывающих опасные, особо опасные, в том числе зооантропонозные и не встречающиеся на территории страны болезни животных ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии» («ФИЦВиМ») (реестровый номер центра коллективного пользования (ЦКП) – 441429, http://ckp-rf.ru/ckp/441429/).

Питательные среды и растворы. Для культивирования клеток в качестве ростовой среды применяли питательные среды Игла MEM и DMEM («HyClone», США) с добавлением 10% фетальной сыворотки крови КРС (FBS) («HyClone») и антибиотиков (ципрофлоксацин и амфотерицин в конечной концентрации 10 и 5 мкг/мл соответственно).

Первичную клеточную культуру почки получали методом стандартной трипсинизации с использованием 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена. Субкультуры клеток ПЛМ поддерживали общепринятой методикой последовательных пересевов при температуре 37 ± 0,5 °С в атмосфере с повышенным до 5% содержанием углекислого газа и относительной влажности 95%.

Криоконсервирование клеток проводили в ростовой среде с добавлением криопротектора – 10% DMSO (Dimethyl Sulfoxide for cell culture), «Sigma», США) с эквилибрацией при 4 °С в течение 60 мин и последующим быстрым замораживанием при −70 °С; через 14 сут клетки подвергали глубокому замораживанию в жидком азоте (−196 °С).

Для кариологического исследования клеточную культуру на стадии активного роста инкубировали в среде с колхицином (0,05 мкг/мл среды) в течение 2 ч. Клетки диспергировали смесью 0,02% раствора Версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 7 : 1, подогретой до 37,0 ± 1,0 °С. Проводили гипотоническую обработку клеток в суспензии (1 часть FBS и 4 части дистиллированной воды) и выдерживали в термостате 25–40 мин, фиксировали в смеси метанола с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3 : 1, наносили на поверхность предметных стёкол и окрашивали 2% водным раствором красителя Романовского–Гимзы [29, 30].

Для определения пермиссивности полученных клеток соответствующий вирусный материал инокулировали в культуральные флаконы (по 5 для каждого вируса) с конфлюэнтным клеточным монослоем, для чего из флаконов удаляли ростовую среду и вносили вирус в дозе 0,1–0,01 ТЦД50/кл. Адсорбцию последнего проводили в течение 60 мин. Затем вносили поддерживающую среду, содержащую 2% FBS, и инфицированные культуры инкубировали при 37,0 ± 0,5 °C до наступления выраженного ЦПД вируса. Пермиссивность клеток к возбудителям миксомы кроликов и фибромы Шоупа определяли при множественности заражения 0,5–0,7 и 0,001–0,002 ИД50/кл соответственно (ИД – инфекционная доза). Адсорбцию и культивирование вируса осуществляли при 33,0 ± 0,5 °C.

Инфекционную активность устанавливали путём титрования в пермиссивных для каждого патогена клеточных культурах, учитывали развитие ЦПД; титр вируса рассчитывали по методике Рида и Менча в модификации Ашмарина.

Идентификация вируса блютанга, полученного в культуре штамма диплоидных клеток ПЛМ вида P. nathusii, проведена методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Идентификация полевого изолята вируса ЗУД КРС осуществлена путём ПЦР в реальном времени по методике Bowden T.R. и соавт. [31] с олигонуклеотидными праймерами CaPV-074F1 (5’-AAA ACG GTA TAT GGA ATA GAG TTG GAA-3’), CaPV-074R1 (5’-AAA TGA AAC CAA TGG ATG GGA TA-3’) и гибридизационным зондом CaPV-074P1 (5’-6FAM-TGG CTC ATA GAT TTC CT-MGB-NFQ-3’).

Результаты обрабатывали статистически с использованием программы Microsoft Excel 2010. Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента–Фишера.

Результаты

Все эксперименты на животных проводили в соответствии с российским законодательством и рекомендациями этического комитета ФГБНУ «ФИЦВиМ» (Владимирская область, пос. Вольгинский).

Получение первичных культур клеток

Летучие мыши вида P. nathusii (рис. 1) были отловлены с использованием туман-сети в Волгоградской области и доставлены в лабораторию ФГБНУ «ФИЦВиМ».


Рис. 1
. Летучая мышь, самец, вид нетопырь Натузиуса (Pipistrellus nathusii).
Fig. 1. Bat male of Nathusius’ pipistrelle (Pipistrellus nathusii).

Эвтаназию животных осуществляли путём внутрибрюшинного введения 0,5 мл 70% этилового спирта и цервикальной дислокацией шейных позвонков через 2 мин после остановки сердца [32]. При вскрытии отделяли почки, которые помещали в отдельные ёмкости, содержащие среду Игла MEM с добавлением антибиотиков (20 мкг/мл ципрофлоксацина и 5 мкг/мл амфотерицина В). После удаления почечных лоханок и мозгового вещества корковый слой почек механически измельчали на фрагменты размером около 2–3 мми отмывали от крови 4 раза средой Игла MEM до получения прозрачных сливов. Затем материал переносили в коническую плоскодонную колбу объёмом 500 мл и заливали смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в соотношении 2 : 1 при температуре 37 °C. Ферментативную дезагрегацию осуществляли посредством перемешивания тканевой суспензии на магнитной мешалке в течение 15 мин. После интенсивного помутнения диспергирующего раствора колбу снимали с мешалки, давали отстояться в течение 2 мин и сливали клеточную суспензию во флакон объёмом 500 мл. Данную процедуру повторяли 3 раза до полного истощения ткани. К клеткам в диспергирующем растворе добавляли FBS для нейтрализации трипсина.

В дальнейшем полученную суспензию центрифугировали при 700 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость декантировали, а осадок с клетками ресуспендировали в 25 мл ростовой среды. Клеточную суспензию фильтровали через марлевый фильтр для удаления не подвергшихся воздействию трипсина фрагментов почечной ткани, тщательно перемешивали и отбирали пробу суспензии для подсчёта клеточных элементов в камере Горяева. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим составила 78–81%. Клеточную суспензию доводили до посевной концентрации 400 тыс. кл/мл ростовой средой и разливали в пластиковые флаконы площадью 25 см(«Corning», США). После 24 ч культивирования клеточный монослой промывали средой с антибиотиками, удаляя не прикрепившиеся и мёртвые клетки, после чего проводили смену ростовой питательной среды. В дальнейшем среду меняли каждые 2–3 сут.

Последовательные пересевы клеточной культуры осуществляли с использованием одних и тех же серий питательной среды и сыворотки (DMEM 90% и FBS – 10%).

Первично-трипсинизированная культура был представлена разнородными в морфологическом отношении клеточными популяциями с преимущественным преобладанием эпителиоподобных клеток (рис. 2), образующих вначале островковый клеточный рост, и формированием конфлюэнтного монослоя на 5-е сут культивирования.


Рис. 2
. Первично-трипсинизированная культура клеток почки летучей мыши Pipistrellus nathusii: a – через 24 ч культивирования, б – через 72 ч культивирования, в – спустя 24 ч после 1-го субпассажа, г – конфлюэнтный монослой 2-го пассажа (микрофотография, увеличение ×150).
Fig. 2. Primary trypsinized cell culture of Pipistrellus nathusii kidney: а – after 24 hs of cultivation, b – after 72 hs of cultivation, c – in 24 hs after the 1st subpassage, d – confluent monolayer of the 2nd passage (microphotograph, magnification ×150).

Дальнейшее культивирование клеток проводили с пересевом 2–3 раза в неделю. При посевной концентрации 120–150 тыс. кл/мл формирование конфлюэнтного монослоя наблюдали через 72 ч, при этом индекс пролиферации (ИП) составлял 2,7–3,3. Клеточный монослой без признаков дегенерации клеток и проявлений ЦПД сохранялся без смены среды на протяжении 45 сут (срок наблюдения).

При морфологическом изучении субкультур установлено, что монослой культуры ПЛМ представлен преимущественно эпителиоподобными полигональными клетками с ядром овальной или эллипсовидной, реже округлой формы с 1–3 (иногда больше) округлыми ядрышками, варьирующими по размеру. Ядерный матрикс равномерный. При пассировании клеточный монослой сохранял характерную типичную морфологию (рис. 3).


Рис. 3
. Монослой культуры клеток почки летучей мыши Pipistrellus nathusii на уровне 5-го пассажа (микрофотография, увеличение ×150).
Fig. 3. Monolayer of the kidney cell culture of the bat Pipistrellus nathusii at the 5th passage level (microphotograph, magnification ×150).

В результате последовательных пересевов в среде Игла DMEM с 10% FBS получены субкультуры, и на уровне 4-, 10-, 13-, 18-, 20-, 22-, 28- и 33-го пассажей созданы криобанки данной культуры в жидком азоте.

После размораживания на нулевом пассаже жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим составляла от 78 до 85%, клеточный монослой формировался на 2-е сут культивирования и был представлен типичными эпителиоподобными клетками.

Целями кариологического анализа культуры клеток почки нетопыря лесного (P. nathusii) стали как подтверждение видовой принадлежности, так и оценка стабильности хромосомного набора клеток в условиях длительного культивирования.

Как отмечено рядом исследователей, виды рода Pipistrellus обладают значительным внутриродовым кариологическим полиморфизмом и внутривидовой стабильностью [33]. Количество хромосом в их клетках варьирует от 26 до 44, а число плеч аутосом (NFa) – от 44 до 56 [34], поэтому хромосомные характеристики для представителей этого рода являются надёжным видовым признаком.

Анализ 50 метафазных пластинок клеточной культуры, проведённый на 2-м и 3-м пассажных уровнях после криоконсервации и на уровне 36-го пассажа – в условиях непрерывного субкультивирования, показал, что модальный класс хромосом культуры клеток соответствует диплоидному набору (2n = 44) данного вида при NFa = 50. Полученные результаты согласуются с данными хромосомного анализа ряда других представителей рода Pipistrellus, таких как кожановидный нетопырь (Pipistrellus savii koreensis) и средиземноморский нетопырь, или нетопырь Куля (P. Kuhli) [35, 36].

Кариологические исследования культуры клеток ПЛМ на уровне 36-го пассажа в условиях непрерывного субкультивирования показали стабильность кариотипа, который сохранял как диплоидный набор хромосом, так и отсутствие хромосомных перестроек и образования маркерных хромосом (рис. 4).


Рис. 4
. Метафазная пластинка культуры клеток почки летучей мыши Рipistrellus nathusii (микрофотография, увеличение ×900).
Fig. 4. Metaphase plate of the kidney cell culture of the bat Pipistrellus nathusii (microphotograph, magnification ×900).

По совокупности цитоморфологических, ростовых и кариологических показателей начиная с 6-го пассажа клеточная культура соответствовала характеристике диплоидного штамма и получила наименование «Штамм диплоидных клеток почки летучей мыши Pipistrellus nathusii (Diploid cell line Pipistrellus nathusii kidney)».

При изучении чувствительности штамма диплоидных клеток ПЛМ P. nathusii к вирусу блютанга с множественностью заражения 0,1–0,01 ТЦД50/кл на 2-е сут отмечено незначительное ЦПД в виде формирования тяжей из веретенообразных клеток. На 3-и сут наблюдали округление и отслоение инфицированных клеток от подложки с лизисом и деструкцией клеточного монослоя. В контрольной культуре подобных изменений не выявлено (рис. 5).


Рис. 5
. Цитопатическое действие вируса блютанга в культуре штамма диплоидных клеток почки летучей мыши Pipistrellus nathusii, 12-й пассаж: а – контрольная клеточная культура, б – культура клеток на 3-и сут после заражения (микрофотография, увеличение ×150).
Fig. 5. Cytopathic effect of BTV in the culture of the diploid kidney cell strain of the bat Pipistrellus nathusii, 12th passage: a – control cell culture, b – cell culture in 3 days after infection (microphotograph, magnification ×150).

ИА вируса, полученного в исследуемой культуре, при титровании в 2-суточной культуре перевиваемой линии клеток почки африканской зелёной мартышки (Vero) составила 5,5 lg ТЦД50/мл.

Для определения чувствительности к возбудителю ЛДР вирус с множественностью заражения 0,1–0,01 ТЦД50/кл инокулировали в культуральные флаконы с конфлюэнтным монослоем штамма диплоидных клеток ПЛМ P. nathusii. На 3-и сут инкубации отмечены начальные признаки развития ЦПД в виде появления тяжей веретенообразных клеток. На 5-е сут имели место округление и отслоение инфицированных клеток от подложки на фоне лизиса и деструкции клеточного монослоя. В контрольной культуре подобных изменений также не зарегистрировано (рис. 6).


Рис. 6
. Цитопатическое действие вируса ЛДР в культуре штамма диплоидных клеток почки летучей мыши Pipistrellus nathusii 12-го пассажа: а – контрольная культура клеток, б – культура клеток на 3-и сут после заражения, в – культура клеток на 5-е сут после заражения (микрофотография, увеличение ×150).
Fig. 6. Cytopathic effect of RVFV in the culture of the diploid kidney cell strain of the bat Pipistrellus nathusii, 12th passage: а – control cell culture, b – cell culture on day 3 after infection, c – cell culture on day 5 after infection (microphotograph, magnification ×150).

Значение ИА возбудителя ЛДР при титровании в 2-суточной культуре перевиваемой клеточной линии Vero было равным 5,25 lg ТЦД50/мл.

Изучение пермиссивности полученного штамма к вирусу ЗУД КРС проводили в отношении полевого изолята, выделенного с использованием первичной культуры клеток ТК. Как и в вышеописанных опытах, вирус ЗУД вызывал в исследуемой культуре развитие ЦПД на 3-и сут, выражающегося в формировании тяжей из веретенообразных клеток. На 5-е сут наблюдали округление и отслоение инфицированных клеток от подложки, а также лизис и деструкцию клеточного монослоя. В контрольной культуре аналогичных изменений не отмечено (рис. 7).


Рис. 7
. Цитопатическое действие вируса ЗУД КРС в культуре штамма диплоидных клеток почки летучей мыши Pipistrellus nathusii 10-го пассажа: а – контрольная клеточная культура, б – культура клеток на 3-и сут после заражения (микрофотография, увеличение ×150).
Fig. 7. Cytopathic effect of LSDV in the culture of the diploid kidney cell strain of a bat Pipistrellus nathusii, 10th passage: a – control cell culture, b – cell culture in 3 days after infection (microphotography, magnification ×150).

Показатель ИА полевого изолята вируса ЗУД, полученного на 5-е сут культивирования в исследуемой культуре, составил 5,25 lg ТЦД50/мл.

Исследование пермиссивности клеточного материала ПЛМ P. nathusii к возбудителям АЧЛ и АЧС показало, что клетки культуры не поддерживали репродукцию этих вирусов. На протяжении 10 сут наблюдения клеточный монослой инфицированных культур морфологически не отличался от контрольных, а тест-культуры (СV-1 и лейкоциты свиньи соответственно) не показали нарастания ИА в материалах заражённых культур клеток.

В инфицированной вирусом миксомы кроликов (Myxomatosis cuniculi) исследуемой культуре на 3-и сут инкубирования наблюдали ЦПД вируса в виде образования стяжек (рис. 8). На 5-е сут отмечали округление и отслоение инфицированных клеток от подложки, деструкцию клеточного монослоя.

Значение ИА вируса миксомы кроликов, полученного в исследуемой культуре, было равным
4,25 ± 0,25 lg ТЦД50/мл.

Исследование пермиссивности полученных клеток к вирусу фибромы Шоупа проводили на кроликах с патогенным для них изолятом возбудителя, выделенным из патологического материала, с ИА на уровне 5-го пассажа 4,11 lg ИД50/мл. Методом ПЦР подтверждена аутентичность использованного вируса.

Результаты определения вирусрепродуцирующей способности культуры штамма диплоидных клеток ПЛМ P. nathusii в отношении вирулентного вируса фибромы Шоупа показали отсутствие развитие цитопатического эффекта, а титр ИА не превышал введённую дозу инфекционного агента.

Обсуждение

Изучение спектра чувствительности клеток из тканей летучих мышей, обитающих и мигрирующих на территории Российской Федерации, к вирусам векторных инфекций сельскохозяйственных животных, для которых имеет место риск заноса и распространения, является актуальным, в особенности для возбудителей трансмиссивных вирусных болезней.

Все разновидности летучих мышей, обитающих в России (около 40 видов), – насекомоядные. По оценкам специалистов, 1 особь в течение 1 ч охоты съедает до 200 комаров, которые, в свою очередь, могут выступать переносчиками возбудителей многих трансмиссивных заболеваний. Ежегодная миграция части популяций летучих мышей средней полосы РФ на юг простирается на ареал Средиземного и Чёрного морей, Закавказья, северного Ирана и северной Турции (http://vertebrata.ru/index/lesnoj_netopyr/0-407), в том числе на регионы, стационарные по особо опасным болезням сельскохозяйственных животных. Данные по изоляции патогенов от летучих мышей в различных регионах мира (включая вирусы особо опасных болезней) указывают на необходимость подобных исследований для РФ, где роль рукокрылых в распространении возбудителей указанных болезней не получила достаточного экспериментального подтверждения.

Полученный штамм диплоидных клеток ПЛМ P. nathusii сохранял цитоморфологические, ростовые и кариологические характеристики на протяжении 36 пассажей (срок наблюдения), что позволило создать крупный криобанк этих клеток на разных пассажных уровнях и оценить их пермиссивность к вирусам – возбудителям экономически значимых и карантинных заболеваний.

Показатели чувствительности полученной клеточной культуры к вирусам блютанга и ЛДР согласуются с данными об идентификации реовируса и возбудителя ЛДР у египетских фруктовых летучих мышей [37, 38], а пермиссивность полученного штамма диплоидных клеток ПЛМ P. nathusii к вирусам ЗУД КРС и миксомы кроликов (Myxomatosis cuniculi) соответствует результатам обнаружения поксвирусов у летучих мышей вида поздний кожан (Eptesicus fuscus) [39]. Кроме того, данный клеточный штамм также может быть использован для выделения и изучения вирусных патогенов – возбудителей инфекционных болезней человека.

Выводы

1. Впервые получен и паспортизирован штамм диплоидных клеток ПЛМ Pipistrellus nathusii. Создан криобанк этого штамма на разных пассажных уровнях для вирусологических исследований.

2. Установлена пермиссивность полученного клеточного штамма к вирусам блютанга, ЛДР, ЗУД, миксомы кроликов. Данная культура клеток оказалась нечувствительной к возбудителям АЧЛ, АЧС и фибромы Шоупа.

3. Методом ПЦР подтверждена таксономическая принадлежность полевых изолятов вирусов ЗУД и фибромы Шоупа, используемых в экспериментальной работе с культурой клеток летучей мыши.

4. Репродукция возбудителей трансмиссивных болезней сельскохозяйственных животных в клетках диплоидного штамма из тканей летучей мыши P. nathusii, обитающей и мигрирующей на территории европейской части Российской Федерации, свидетельствует о возможности вирусоносительства представителями указанного вида, а также их потенциальном участии в эпидемическом процессе в качестве переносчиков вирусов из сопредельных с РФ территорий. Это, в свою очередь, позволяет говорить о роли данных животных в формировании природных резервуаров инфекций.

Список литературы

1. IUCN SSC Bat Specialist Group. Available at: https://www.iucn.org/commissions/ssc-groups/mammals/specialist-groups-a-e/bat (accessed January 18, 2021).

2. Baker M.L., Schountz T., Wang L.F. Antiviral immune responses of bats: a review. Zoonoses Public Health. 2013; 60(1): 104-16. https://doi.org/10.1111/j.1863-2378.2012.01528.x.

3. Calisher C.H., Childs J.E., Field H.E., Holmes K.V, Schountz T. Bats: Important reservoir hosts of emerging viruses. Clin. Microbiol. Rev. 2006; 19(3): 531-45. https://doi.org/10.1128/CMR.00017-06.

4. Wang L.F., Walker P.J., Poon L.L. Mass extinctions, biodiversity and mitochondrial function: are bats ‘special’ as reservoirs for emerging viruses? Curr. Opin. Virol. 2011; 1(6): 649-57. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2011.10.013.

5. Drexler J.F., Corman V.M., Wegner T., Tateno A.F., Zerbinati R.M., Gloza-Rausch F., et al. Amplification of emerging viruses in a bat colony. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(3): 449-56. https://doi.org/10.3201/eid1703.100526.

6. Moratelli R., Calisher C.H. Bats and zoonotic viruses: can we confidently link bats with emerging deadly viruses? Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2015; 110(1): 1-22. https://doi.org/10.1590/0074-02760150048.

7. Макаров В.В., Лозовой Д.А. Вирусы и рукокрылые. Эпидемиологические особенности восприимчивости. Пест-Менеджмент. 2017; (4): 13-22.

8. Vazquez-Moron S., Juste J., Ibanez C., Berciano J.M., Echevarria J.E. Phylogeny of European Bat Lyssavirus 1 in Eptesicus isabellinus Bats, Spain. Emerg. Infect. Dis. 2011; 17(3): 520-3. https://doi.org/10.3201/eid1703.100894.

9. Ceballos N.A., Moron S.V., Berciano J.M., Nicolas O., Lopez C.A., Juste J., et al. Novel lyssavirus in Bat, Spain. Emerg. Infect. Dis. 2013; 19(5): 793-5. https://doi.org/10.3201/eid1905.121071.

10. Ge X.Y., Li J.L., Yang X.L., Chmura A.A., Zhu G., Epstein J.H., et al. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavi-rus that uses the ACE2 receptor. Nature. 2013; 503(7477): 535-8. https://doi.org/10.1038/nature12711.

11. Janoska M., Vidovszky M., Molnar V., Liptovszky M., Harrach B., Benko M. Novel adenoviruses and herpesviruses detected in bats. Vet. J. 2011; 189(1): 118-21. https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2010.06.020.

12. Leroy E.M., Kumulungui B., Pourrut X., Rouquet P., Hassanin A., Yaba P., et al. Fruit bats as reservoirs of Ebola virus. Nature. 2005; 438(7068): 575-6. https://doi.org/10.1038/438575a.

13. Kohl C., Lesnik R., Brinkmann A., Ebinger A., Radonic A., Nitsche A., et al. Isolation and characterization of three mammalian orthoreo-viruses from European bats. PLoS One. 2012; 7(8): e43106. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0043106.

14. Chua K.B., Koh C.L., Hooi P.S., Wee K.F., Khong J.H., Chua B.H., et al. Isolation of Nipah virus from Malaysian Island flying-foxes. Microbes Infect. 2002; 4(2): 145-51. https://doi.org/10.1016/s1286-4579(01)01522-2.

15. Halpin K., Young P.L., Field H.E., Mackenzie J.S. Isolation of Hen-dra virus from pteropid bats: a natural reservoir of Hendra virus. J. Gen. Virol.2000; 81(Pt. 8): 1927-32. https://doi.org/10.1099/0022-1317-81-8-1927.

16. Albarino C.G., Foltzer M., Towne J.S., Rowe L.A., Campbell S., Jaramillo C.M., et al. Novel paramyxovirus associated with severe acute febrile disease, South Sudan and Uganda, 2012. Emerg. Infect. Dis. 2014; 20(2): 211-6. https://doi.org/10.3201/eid2002.131620.

17. Waruhiu C., Ommeh S., Obanda V., Agwanda B., Gakuya F., Ge X.Y, et al. Molecular detection of viruses in Kenyan bats and discovery of novel astroviruses, caliciviruses and rotaviruses. Virol. Sin. 2017; 32(2): 101-14. https://doi.org/10.1007/s12250-016-3930-2.

18. Zhang H., Todd S., Tachedjian M., Barr J.A., Luo M., Yu M., et al. A novel bat herpesvirus encodes homologues of major histocompatibility complex classes I and II, C-type lectin, and a unique family of immune-related genes. J. Virol. 2012; 86(15): 8014-30. https://doi.org/10.1128/jvi.00723-12.

19. Graves D.C., Ferrer J.F. In vitro transmission and propagation of the bovine leukemia virus in monolayer cell cultures. Cancer Res. 1976; 36(11 Pt. 1): 4152-9.

20. Sandekian V., Lim D., Prud’homme P., Lemay G. Transient high level mammalian reovirus replication in a bat epithelial cell line occurs without cytopathic effect. Virus Res. 2013; 173(2): 327-35. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2013.01.010.

21. Slater T., Eckerle I., Chang K. Bat lung epithelial cells show greater host species-specific innate resistance than MDCK cells to human and avian influenza viruses. Virol. J. 2018; 15(1): 68. https://doi.org/10.1186/s12985-018-0979-6.

22. Jordan I., Horn D., Oehmke S., Leendertz F.H., Sandig V. Cell lines from the Egyptian fruit bat are permissive for modified vaccinia Ankara. Virus Res. 2009; 145(1): 54-62. https://doi.org/10.1016/).virusres.2009.06.007.

23. Crameri G., Todd S., Grimley S., McEachern J.A., Marsh G.A., Smith C., et al. Establishment, immortalisation and characterisation of pteropid bat cell lines. PLoS One. 2009; 4(12): e8266. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0008266.

24. Banerjee A., Misra V., Schountz T., Baker M.L. Tools to study pathogen-host interactions in bats. Virus Res. 2018; 248: 5-12. https://doi.org/10.1016.

25. Biesold S.E., Ritz D., Gloza-Rausch F., Wollny R., Drexler J.F., Corman V.M., et al. Type I interferon reaction to viral infection in interferon-competent, immortalized cell lines from the African fruit bat Eidolon helvum. PLoS One. 2011; 6(11): e28131. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028131.

26. Zhou P., Chionh Y.T., Irac S.E., Ahn M., Jia Ng J.H., Fossum E., et al. Unlocking bat immunology: establishment of Pteropus alec-to bone marrow-derived dendritic cells and macrophages. Sci. Rep. 2016; 6: 38597. https://doi.org/10.1038/srep38597.

27. Irving A.T., Rozario P., Kong P., Luko K., Gorman J.J., Hastie M.L., et al. Robust dengue virus infection in bat cells and limited innate immune responses coupled with positive serology from bats in In-doMalaya and Australasia. Cell. Mol. Life Sci. 2020; 77(8): 1607-22. https://doi.org/10.1007/s00018-019-03242-x.

28. Жуков В.А., Шишкина Л.Н., Сафатов A.C., Сергеев A.A., Пьян-ков О.В., Петрищенко В.А. и др. Валидация модифицированного алгоритма прогнозирования восприимчивости хозяина к вирусам с учетом параметров восприимчивости первичных культур клеток-мишеней и факторов врожденного иммунитета. Вестник Российской академии медицинских наук. 2010; (5): 24-9.

29. Ford C.E., Hamerton J.L. A colchicine, hypotonic citrate, squash sequence for mammalian chromosomes. Stain Technol. 1956; 31(6): 247-51. https://doi.org/10.3109/10520295609113814.

30. Rothfels K.H., Siminovitch L. Air drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technol. 1958; 33(2): 73-7. https://doi.org/10.3109/10520295809111827.

31. Bowden T.R., Babiukb S.L., Parkynb G.R., Coppsb J.S., Boylea D.B. Capripoxvirus tissue tropism and shedding: A quantitative study inexperimentally infected sheep and goats. Virology. 2008; 371 (2) 380-393. https://doi.org/10.1016/j.virol.2007.10.002.

32. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals (Formerly AVMA Guidelines on Euthanasia): 2013 Edition. Available at: https://www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx (accessed January 18, 2021).

33. Воронцов Н.Н., Раджабли С.И., Волобуев В.Т. Сравнительная кариология летучих мышей семейства Vespertilionidae (Chiro-ptera). В кн.: Млекопитающие (эволюция, кариология, систематика, фаунистика). Новосибирск: Наука; 1969: 16-21.

34. Baker R.J. Karyotypic trends in bats. In: Wimsatt W.A., ed. Biology of bats. Academic Press Inc.: New York; 1970, 65-97. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-758001-2.50007-1.

35. Park S.R., Won P.O. Chromosomes of Korean bats. J. Mammal. Soc. Jpn. 1978; (7): 199-203. https://doi.org/10.11238/jmammsocjapan1952.7.1999.

36. Дзуев Р.И., Хашкулова М.А., Боготова И.Х. Особенности хромосомного набора и промеров тела средиземноморского нетопыря (Pipisrellus Kuhli) в условиях лесостепного пояса северного макросклона Центрального Кавказа. Современные проблемы науки и образования. 2016; (3): 390.

37. Balkema-Buschmann A., Rissmann M., Kley N., Ulrich R., Eiden M., Groschup M.H. Productive propagation of Rift valley fever phlebovi-rus vaccine strain MP-12 in Rousettus aegyptiacus fruit bats. Viruses. 2018; 10(12): 681. https://doi.org/10.3390/v10120681.

38. Fagre A.C., Lee J.S., Kityo R.M., Bergren N.A., Mossel E.C., Nakayiki T., et al. Discovery and characterization of Bukakata orbivirus (Reoviridae: Orbivirus), a novel virus from a Ugandan bat. Viruses. 2019; 11(3): 209. https://doi.org/10.3390/v11030209.

39. Emerson Ginny L., Nordhausen R., Garner M.M., Huckabee J.R., Johnson S., Wohrle R.D., et al. Novel Poxvirus in big brown bats, Northwestern United States. Emerg InfectDis. 2013; 19(6): 1002-4. https://doi.org/10.3201/eid1906.121713.


Об авторах

О. С. Поволяева
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Поволяева Ольга Сергеевна - аспирант, микробиолог.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский


С. Г. Юрков
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Юрков Сергей Григорьевич - доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



О. Г. Лаптева
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Лаптева Оксана Георгиевна - кандидат вет. наук, старший научный сотрудник.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



О. Л. Колбасова
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Колбасова Ольга Львовна - кандидат биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



А. А. Чадаева
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Чадаева Анна Александровна – микробиолог.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



А. Ю. Кольцов
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Кольцов Андрей Юрьевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



И. П. Синдрякова
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Синдрякова Ирина Петровна - кандидат биологических наук, заведующий сектором лаборатории диагностики и мониторинга.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



М. Е. Власов
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Власов Михаил Евгеньевич - заместитель руководителя группы.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



С. П. Живодёров
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Живодёров Сергей Петрович - кандидат вет. наук, заведующий научно-экспериментальным отделом.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



А. В. Луницин
ФГБНУ Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии Минобрнауки России
Россия

Луницин Андрей Владимирович - старший научный сотрудник, заместитель директора по производству и качеству.

601125, Владимирская область, пос. Вольгинский



Для цитирования:


Поволяева О.С., Юрков С.Г., Лаптева О.Г., Колбасова О.Л., Чадаева А.А., Кольцов А.Ю., Синдрякова И.П., Власов М.Е., Живодёров С.П., Луницин А.В. Биологическая характеристика и пермиссивность к вирусам штамма диплоидных клеток почки летучей мыши нетопыря Натузиуса (Pipistrellus nathusii Keyserling & Blasius, 1839; (Chiroptera: Microchiroptera: Vespertilionidae). Вопросы вирусологии. 2021;66(1):29-39. https://doi.org/10.36233/0507-4088-12

For citation:


Povolyaeva O.S., Yurkov S.G., Lapteva O.G., Kolbasova O.L., Chadaeva A.A., Kol'tsov А.Yu., Sindryakova I.P., Vlasov M.E., Zhivoderov S.P., Lunitsin A.V. Biological characteristics and permissiveness to viruses of diploid kidney cells strain from the bat Nathusius’ pipistrelle (Pipistrellus nathusii Keyserling & Blasius, 1839; Chiroptera: Microchiroptera: Vespertilionidae). Problems of Virology. 2021;66(1):29-39. (In Russ.) https://doi.org/10.36233/0507-4088-12

Просмотров: 145


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0507-4088 (Print)
ISSN 2411-2097 (Online)