Preview

Вопросы вирусологии

Расширенный поиск

Разработка метода количественного определения вирусной РНК для контроля специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом

https://doi.org/10.36233/0507-4088-30

Полный текст:

Аннотация

Введение. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) занимает ведущее место среди природно-очаговых болезней человека в Российской Федерации. Этиотропная терапия заболевания в настоящее время отсутствует. Наиболее действенным методом контроля этой инфекции может стать вакцинопрофилактика. Основными критериями оценки инактивированной вакцины являются её иммуногенность и специфическая активность.

Цель исследования - разработка чувствительной и специфичной методики проведения ПЦР в реальном времени с целью количественного определения вирусной РНК в инактивированной вакцине, а также установление корреляции между содержанием генетического материала вируса и выраженностью иммуногенности. Материал и методы. В качестве диагностической мишени для олигонуклеотидов и флуоресцентных зондов выбраны фрагменты L-сегмента вакцинных штаммов вирусов ГЛПС Пуумала, Хантаан, Сочи. Иммуногенность экспериментальных вакцин контролировали по индукции нейтрализующих антител (нАТ) в ответ на иммунизацию мышей линии BALB/c.

Результаты. Разработана высокоспецифичная, чувствительная методика проведения ПЦР в реальном времени, имеющая высокий показатель воспроизводимости. Аналитическая чувствительность составила для вирусов Пуумала 1,24 ± 1,5 х 102 копий/мл, Хантаан - 1,16 ± 1,4 х 102 копий/мл, Сочи - 1,32 ± 1,8 х 102 копий/мл при содержании вируса 1,5 ± 0,5, 1,8 ± 0,5 и 2,2 ± 0,5 lg ФОЕ/мл соответственно. Показано, что количество вирусной РНК в составе экспериментальных вакцинных препаратов, инактивированных β-про-пиолактоном (β-ПЛ), пропорционально титру нАТ в ответ на иммунизацию.

Обсуждение. Установлено, что способ инактивирования вируса влияет на выявляемое количество копий РНК, не оказывая при этом воздействия на иммуногенность, что указывает на равнозначное повреждение белков-иммуногенов при разной степени повреждения вирусной РНК. Прямая зависимость между содержанием копий нуклеиновой кислоты вируса и иммуногенностью позволяет использовать этот критерий для дозирования вакцинного препарата.

Заключение. Разработанная система оценки количественного содержания вирусной РНК делает перспективным её применение для контроля специфической активности вакцины против ГЛПС.

Для цитирования:


Егорова М.С., Курашова С.С., Ишмухаметов А.А., Баловнева М.В., Девяткин А.А., Сафонова М.В., Ожерелков С.В., Хапчаев Ю.Х., Балкина А.С., Белякова А.В., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. Разработка метода количественного определения вирусной РНК для контроля специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Вопросы вирусологии. 2021;66(1):65-73. https://doi.org/10.36233/0507-4088-30

For citation:


Egorova M.S., Kurashova S.S., Ishmukhametov A.A., Balovneva M.V., Deviatkin A.A., Safonova M.V., Ozherelkov S.V., Khapchaev Yu.K., Balkina A.S., Belyakova A.V., Dzagurova T.K., Tkachenko E.A. Real-time PCR assay development for the control of vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome. Problems of Virology. 2021;66(1):65-73. https://doi.org/10.36233/0507-4088-30

Введение

Возбудители геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), относящиеся к роду Orthohantavirus (семейство Hantaviridae, отряд Bunyavirales), представляют собой группу оболочечных РНК-вирусов с негативным геномом. Они вызывают заболевания человека, известные как геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) в Европе и Азии и хантавирусный пульмональный синдром (ХПС) на территории Северной и Южной Америки [1–3].

Геном хантавирусов состоит из односпиральной 3-сегментированной РНК отрицательной полярности: большой L-сегмент кодирует вирусную РНК-полимеразу, средний (М-сегмент) кодирует 2 поверхностных гликопротеина Gn/Gc и малый S-сегмент – вирусный нуклеокапсидный белок (N) [4–6].

ГЛПС занимает ведущее место среди природноочаговых болезней в Российской Федерации. Около 98% случаев ассоциировано с вирусом Пуумала (ПУУ), остальные – с вирусами Хантаан (ХТН), Сочи (СОЧИ), Амур, Сеул и Куркино [7].

Специфического лечения хантавирусных инфекций, способствующего эффективной элиминации возбудителя, на сегодняшний день нет; средства неспецифической профилактики часто малоэффективны [8]. В этой связи вакцинопрофилактика этих заболеваний остаётся актуальной задачей. К настоящему времени коммерческие инактивированные цельновирионные вакцины против ГЛПС производятся в Китайской Народной Республике (КНР) и Республике Корея на основе разновидностей Хантаан и Сеул [9], однако они не обладают перекрестной защитой против вируса Пуумала, ответственного за подавляющее большинство случаев болезни в Европе и России. Вследствие одновременной циркуляции на территории РФ хантавирусов ПУУ, ХТН и СОЧИ (генотип ортохантавируса Добрава/Белград) [7] наиболее эффективным может стать поливалентный инактивированный цельновирионный вакцинный препарат.

Специфическая активность и иммуногенность служат важнейшими критериями оценки инактивированной вакцины. В технологическом цикле производства после инактивирования возбудителя специфическую активность контролируют, как правило, по количественному содержанию целевого белка-иммуногена либо по числу копий РНК в единице объёма [10].

Цель исследования состояла в разработке чувствительного и специфичного количественного метода обнаружения РНК вакцинных штаммов в инактивированных вакцинах против ГЛПС, а также установлении корреляции между содержанием вирусного генетического материала и иммуногенностью.

Материал и методы

Характеристика вакцинного материала. Культура клеток и вирусы. Для получения вируссодержащего субстрата использовали линию перевиваемых клеток почек зелёной мартышки (Cercopithecus aethiops ) Vero, полученную из клеточного банка Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (WHO Vero cell bank ECACC, Accession number 991042), аттестованную и рекомендованную ВОЗ и Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГИСК) ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России в качестве возможного субстрата для производства инактивированных цельновирионных вакцинных препаратов.

Разработку контроля вирусной РНК методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦРРВ) осуществляли на препаратах экспериментальных моновакцин (далее – вакцин), приготовленных на основе вакцинных штаммов вирусов Пуумала (PUUTKD/VERO) – ВАК-ПУУ, Хантаан (HTN-P88/VERO) – ВАК-ХТН и Сочи (DOB-SOCHI/VERO) – ВАК-СОЧИ по ранее описанной методике [11] с применением различных способов инактивирования: формалин (Ф) в конечном разведении 1 : 4000 в течение 35 сут; β-пропиолактон (β-ПЛ) в конечном разведении 1 : 6000 на протяжении 180 мин; ультрафиолетовое (УФ) излучение при толщине слоя 0,3 см на расстоянии 24 см от источника коротковолновых УФ-лучей с длиной волны 253,7 нм в течение 3 мин [12].

Полногеномные сиквенсы указанных штаммов зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами: PUU-TKD/VERO: S – MH251331, M – MH251332, L – MH251333; HTN-P88/VERO: S – MH251328, M – MH251329, L – MH251330 и DOB-SOCHI/VERO: S – MH251334, M – MH251335, L – MH251336.

Оценку количественного содержания вирусного генетического материала выполняли на следующих этапах: 1-й – очищенный концентрат моновалентных препаратов до инактивирования, 2-й – аналогичный концентрат после инактивирования и 3-й – полуфабрикат трёхвалентной вакцины.

Контроль содержания вирусной РНК методом ПЦР-РВ. В качестве диагностической мишени для олигонуклеотидов и флуоресцентных зондов выбраны фрагменты L-сегментов вакцинных штаммов вирусов ПУУ, ХТН и СОЧИ. При выборе праймеров и зондов проводили анализ полногеномных сиквенсов вакцинных штаммов, а также геномов вирусов ПУУ, ХТН и СОЧИ, представленных в GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), при помощи программы MEGA-X (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) с применением стандартных требований. Параметры праймеров рассчитывали в онлайн-сервисе OligoCalc: Oligonucleotide Properties Calculator (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html); термодинамические характеристики флуоресцентных зондов и их вторичные структуры оценивали с помощью The mfold Web Server (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA Folding-Form). Олигонуклеотиды содержали флуоресцентную метку карбоксифлуоресцеин (FAM) на 5’- и гаситель флуоресценции (BHQ2) – на 3’-конце.

Синтез праймеров и зондов проводили в ЗАО «Евроген» (Россия). Разработанные зонды и праймеры представлены в табл. 1.

Выделение РНК и проведение ПЦР-РВ. РНК выделяли из хроматографически очищенного вирусного концентрата до инактивирования (контроль), а также после инактивации (Ф, β-ПЛ, УФ) методом хлороформ-фенольной экстракции [13] с применением коммерческого препарата TRI Reagent® («Sigma-Aldrich», США). Комплементарную ДНК (кДНК) получали путём обратной транскрипции в общем объёме реакционной смеси 20 мкл, содержащей 5× Reverse Transcription (RT) Buffer («Thermo Fisher Scientific», США), 2,5 мМ смеси 4-х немодифицированных высокоочищенных 2’-дезоксинуклеозид-5’-трифосфатов – dNTPs («СибЭнзим», Россия), 20 пМ праймера N6 Random («СибЭнзим»), 1 U обратной транскриптазы Maxima Reverse Transcriptase 200 е.а./мкл («Thermo Fisher Scientific») и 10 мкл раствора РНК. Реакцию проводили при следующих условиях: 10 мин при 25 °С, 30 мин при 42 °С и 6 мин – при 96 °С. Объём реакционной смеси для ПЦР-РВ был равен 25 мкл и включал 10× Hot Start Buffer («Thermo Fisher Scientific»), 2,5 мМ dNTPs, 5 пМ каждого праймера и зонда («Евроген», Россия) (табл. 1), 2 е.а. ДНК-полимеразы HS Taq («Thermo Fisher Scientific»), 2 мкл кДНК и стерильную воду. Режим проведения реакции был следующим: 2 мин при 95 °C и затем 40 циклов по 15 с при 95 °C, 40 с при 55 °C и 30 с – при 72 °C. Амлификацию и детекцию в реальном времени выполняли на амплификаторе AriaMx 96 Bioanalyzer («Agilent Technologies», США).

Таблица 1. Праймеры и зонды
Table 1. Primers and probes

Стандартная кривая. При постановке ПЦР-РВ осуществляли количественное определение целевой РНК в образце. Метод основан на построении стандартной кривой, которая отражает линейное отношение между значением порогового цикла (Сq) и исходным количеством РНК (копий/мл) (рис. 1). Данные кривые получены амплификацией серии 10-кратных серийных разведений стандарта со средними значениями Сq с учётом отрицательных и положительных контролей. Подобным же образом РНК из исходного материала серийно разводили для установления корреляции между Cq и концентрацией вируса, выраженной в фокусобразующих единицах (ФОЕ) на 1 мл. Стандарты готовились из предельных 10-кратных разведений генетического материала вакцинных штаммов ПУУ, ХТН и СОЧИ с известной концентрацией возбудителя (ФОЕ/мл). В ходе исследования определяли количество вирусной нуклеиновой кислоты в 1 мл разведённого препарата и соотносили с величиной ФОЕ/мл.


Рис. 1
. Стандартная кривая зависимости порогового цикла от исходной концентрации РНК вируса Пуумала. Угол наклона (slope) y = −3,44х + 39,59, коэффициент корреляции (R2) = 0,998, эффективность (E) = 110% линейной регрессии кривой. FAM – карбоксифлуоресцеин (флуоресцентная метка).
Fig. 1. Standard curve of the threshold cycle dependence on the initial concentration of Puumala virus RNA. The slope y = −3.44х + 39.59, correlation coefficient (R2) = 0.998, and efficiency (E) = 110% of the linear regression curve. FAM is carboxyfluorescein (fluorescent tag).

Концентрацию стандарта (число копий/мл) устанавливали методом цифровой ПЦР (droplet-digital PCR, ddPCR) в системе QX200 Droplet Digital PCR System («Bio-Rad Laboratory», США), затем проводили пересчёт на количество копий/мл, полученное при ПЦР-РВ. Далее инактивированные образцы анализировали с помощью стандартных кривых для количественного определения целевой РНК вируса.

Специфичность системы. Специфичность выбранных зондов и праймеров оценивали посредством тестирования РНК, выделенной из исходного раствора моновакцины, с другими патогенными для человека хантавирусами: Пуумала (штаммы CG-Kazan-79, Halnaas 83-L20 и Sotkamo); Хантаан (штаммы Ли 83-61 и 76-118); Добрава (Белград-1); Сеул (SR-11 и A9); Sin Nombre (штамм CC/107), а также представителями других семейств: вирусами Крымской-Конго геморрагической лихорадки (штамм IbAr 10200); Денге (штаммы 8356/10, 4397/11, 3140/09 и 3274/09); японского энцефалита (Накаяма); клещевого энцефалита (Hochosterwitz); Западного Нила (MgAn 786/6/1995); Зика (MR766); Усуту (G39); жёлтой лихорадки (Asibi); Чикунгунья (23161) и Ласса (штамм Josiah).

Контроль специфической активности методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для определения антигенов хантавирусов использовали тест-системы «ХАНТАГНОСТ» (ФГБНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН», ФНЦИРИП) в соответствии с инструкцией производителя, а также разработанную «in-house» ХАНТА-N [14].

Титрование фокусобразующих единиц вируса. ФОЕ выявляли на монослое клеток Vero E6 по описанному ранее методу [15]. Количество инфицированных колоний подсчитывали визуально и выражали титр вируса в lg ФОЕ/мл.

Контроль иммуногенности. Иммуногенность экспериментальных вакцинных препаратов против ГЛПС с разными способами инактивирования контролировали в опытах на клинически здоровых половозрелых мышах-самках линии BALB/c массой тела 18‒20 г, полученных из филиала «Андреевка» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» Федерального медико-биологического агентства (ФМБА) России. Исследования на животных проводили в соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных и этическим комитетом ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН.

Животным опытных групп вводили исследуемый препарат в дозе 0,5 мл готовой формы экспериментальных вакцин в неразведённом виде (н/р) и в разведениях 3-кратно внутримышечно с 2-недельными интервалами. Животным контрольной группы вводили в том же объёме 0,9% раствор натрия хлорида (К-ФР).

Мыши BALB/c были распределены по группам в соответствии с вводимыми экспериментальными препаратами:

1 ‒ ВАК-ПУУ-Ф, 2 ‒ ВАК-ПУУ-β-ПЛ, 3 ‒ ВАК-ПУУУФ;

4 ‒ ВАК-ХТН-Ф, 5 ‒ ВАК-ХТН-β-ПЛ, 6 ‒ ВАК-ХТНУФ;

7 ‒ ВАК-СОЧИ-Ф, 8 ‒ ВАК-СОЧИ-β-ПЛ, 9 ‒ ВАКСОЧИ-УФ.

Реакция нейтрализации (РН/ФОЕ50). Нейтрализующие антитела (нАТ) определяли в реакции нейтрализации по 50%-ному подавлению фокусобразующих единиц (РН/ФОЕ50) в клеточной культуре Vero E6 по описанной ранее методике [15].

Статистический анализ. Достоверность результатов исследования оценивали в 3-х сериях экспериментов в идентичных условиях. Все данные проанализированы в программе GraphPad Prism v. 8.2.0. Статистическую значимость определяли с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANalysis Of VAriance, ANOVA) при помощи теста множественных сравнений Тьюка для сравнения средних значений каждого набора данных, при этом величины р <0,05 были отнесены к категории значимых. Статистическая достоверность указывалась как ns (несущественно); p <0,05; p <0,01; p <0,005 и p <0,0001.

Результаты

Флуоресценция по FAM регистрировалась только при исследовании РНК вакцинных штаммов ПУУ, ХТН и СОЧИ. При тестировании остальных возбудителей (включая другие штаммы ПУУ, ХТН и СОЧИ) зафиксирован отрицательный результат, что свидетельствует об отсутствии ложноположительных результатов и высокой специфичности метода.

Для сравнения чувствительности ПЦР-РВ и ИФА использованы образцы последовательных разведений вакцинных штаммов вирусов ПУУ, ХТН и СОЧИ. Чувствительность ПЦР-РВ составила для ПУУ – 1,2 ± 1,5 × 102 копий/мл, что соответствует 1,5 ± 0,5 lg ФОЕ/мл; для ХТН – 1,16 ± 1,4 × 102 копий/мл, что соответствует 1,8 ± 0,5 lg ФОЕ/мл и для СОЧИ – 1,32 ± 1,8 × 102 копий/мл (2,2 ± 0,5 lg ФОЕ/мл). Чувствительность метода ИФА была существенно ниже: для вируса ПУУ – 1 : 256, соответствуя 3,5 lg ФОЕ/мл, для ХТН – 1 : 128, соответствуя 2,8 lg ФОЕ/мл, и для СОЧИ – 1 : 128 (3,2 lg ФОЕ/мл) (табл. 2). Показатели Cq были линейными и коррелировали с концентрацией РНК вирусов ПУУ, ХТН и СОЧИ; значение коэффициента корреляции R= 0,99. Сравнение результатов ПЦР-РВ, ИФА и ФОЕ продемонстрировало, что разработанный метод молекулярно-генетического определения присутствия вируса обладает большей чувствительностью относительно ИФА. Эксперимент выполняли в 3-х повторах с соответствующими отрицательными контролями, измеряя величину стандартного отклонения (М ± m, где М – среднее арифметическое, m – стандартная ошибка среднего). На основании этих данных выявлена корреляция между количеством ФОЕ/мл и числом копий РНК/мл.

Таблица 2. Сравнение чувствительности методов ПЦР-РВ и ИФА
Table 2. Comparison of sensitivity of real-time qPCR and ELISA


Примечание. * – использована ИФА тест-система «ХАНТАГНОСТ»; ** – использована ИФА тест-система «ХАНТА-N»; н.о. – не опре- делялось; n.s. – отсутствует сигнал флюоресценции
Note. * – ELISA test system «HANTAGNOST» was used; ** – ELISA test system «HANTA-N» was used; n.d. – not defined; n.s. – no fluores- cence signal

Количественный контроль содержания вирусной РНК в инактивированной вакцине методом ПЦРРВ. Результаты оценки количественного содержания РНК вирусов ПУУ, ХТН и СОЧИ показали совпадение концентрации возбудителя в образцах со стандартами, содержащими известное количество РНК этих агентов (рис. 1). Данная кривая использована для определения уровня количества копий РНК в вакцинном полуфабрикате после инактивирования (табл. 3).

Таблица 3. Контроль специфической активности вакцинного полуфабриката вирусов Пуумала, Хантаан и Сочи
Table 3. Control specific activity of the vaccine prefabricated Puumala, Hantaan and Sochi viruses products


Примечание. *Контроль – исходный вакцинный полуфабрикат до инактивирования; **СГТ – средний геометрический титр нейтрализу- ющих антител, log2; *** – использованы ИФА тест-системы «ХАНТАГНОСТ» и «ХАНТА-N».
Note. *The control is the initial vaccine prefabricated product before inactivation;**GMT is geometric mean titer of neutralizing antibodies, log2; *** – ELISA test systems «HANTAGNOST» and «HANTA-N» were used.

На фоне воздействия инактиваторов на РНК вирусов ПУУ, ХТН и СОЧИ была выявлена статитстически значимая разница между контрольными образцами (до инактивирования) и образцами, инактивированными разными способами (p <0,0001) (рис. 2). Максимальные потери РНК наблюдались после воздействия УФ, минимальные – после β-ПЛ. Следует отметить, что данные потери неизбежны и обусловлены механизмом действия инактивирующих агентов.


Рис. 2
. Анализ зависимости количества копий РНК от инактивирующего агента/мл. Представлены совокупные результаты 3-х независимых экспериментов с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с тестом множественных сравнений Тьюка. 1 – контроль; 2 – β-пропиолактон; 3 – формалин; 4 – УФ-излучение.

Примечание. *** – p <0,005, **** – p <0,0001.

Fig. 2. Аnalysis of the dependence of the number of RNA copies on the inactivating agent/ml. The combined results of 3 independent experiments using a one-sided analysis of variance (ANOVA) with Tukey’s multiple comparisons test are shown. 1 – control; 2 – β-propiolactone; 3 – formalin; 4 – UV radiation.

Note. *** – p <0.005, **** – p <0.0001.

Контроль иммуногенности. Для контроля иммуногенности экспериментальных вакцинных препаратов исходно использовали 1 пул вирусного сбора с известным титром, инактивированный различными способами.

После иммунизации мышей линии BALB/c препаратами вакцин, инактивированными формалином, β-ПЛ и УФ-лучами, побочных эффектов (как локальных, так и общих) не наблюдалось. При определении иммуногенности методом РН/ФОЕ50 в группах отрицательного контроля титр нАТ не превышал 2,32 log2 и был установлен в качестве предела отсечения. За приемлемый уровень индукции нАТ принимали показатель со средним геометрическим титром (СГТ) выше 4,32 log2.

Не было статистически значимой разницы в титрах нАТ после иммунизации животных моновакцинами, инактивированными формалином, β-ПЛ и УФ-лучами (табл. 3). Несмотря на различное количество копий РНК, выявляемых в дозе инактивированной разными способами вакцины, иммунный ответ не имел существенных отличий (титры нАТ статистически значимо не различались), что свидетельствует о сохранности иммуногенных эпитопов при испытанных способах инактивирования.

С целью выявления корреляции между количеством копий РНК и иммуногенностью мыши BALB/с были иммунизированы ВАК-ПУУ, инактивированной β-ПЛ (ВАК-ПУУ-β-ПЛ), в соответствующих разведениях. В каждом из них определяли количество копий генетического материала на 1 мл и соотносили с титром выявленных после иммунизации нАТ. Результаты опытов показали прямую зависимость между содержанием копий РНК и титром нАТ (табл. 4).

Таблица 4. Корреляция количества копий вирусной РНК с титром нАТ в сыворотках крови мышей линии BALB/c после иммунизации ВАК-ПУУ-β-ПЛ
Table 4. Correlation between RNA copy number and nAB titer in the blood of BALB/c mice following VAC-PUU-β-PL immunization


Примечание. *н/р – неразведённый вакцинный препарат
Note. *u/d – undiluted vaccine preparation

Обсуждение

Ранее контроль специфической активности вакцин осуществлялся посредством определения вирусных антигенов методом ИФА с использованием моноклональных антител к N- и/или G-белкам хантавирусов [14]. В данном исследовании представлена более чувствительная и технологичная методика оценки данной характеристики – ПЦР-РВ на основе полногеномного сиквенса вакцинных штаммов, которая продемонстрировала высокие показатели специфичности, чувствительности и повторяемости для количественного определения соответствующих штаммов в образцах инактивированного вакцинного препарата. В отличие от традиционных методов (ИФА) ПЦРРВ обеспечивает высокую воспроизводимость количественного измерения.

Показана достоверная разница в числе копий РНК до и после инактивирования вакцинного полуфабриката различными способами, включая применение формалина, β-ПЛ и УФ-лучей. При этом иммуногенность этих препаратов не имела существенных различий по количеству индуцируемых нАТ, что указывает на равнозначное повреждение белков-иммуногенов при разной степени разрушения вирусной РНК тестируемыми инактиваторами. В расширенных исследованиях по разработке контроля специфической активности вакцин методом ПЦР-РВ было решено остановиться на β-ПЛ-инактивированных вакцинных препаратах, основное преимущество которых по сравнению с инактивированными формалином и УФ-лучами заключается в снижении содержания балластных белков за счёт уменьшения их агрегации. Это ведёт к более эффективной очистке вируса на этапах осветляющей фильтрации и гель-фильтрации, а также снижению потерь целевого компонента вакцины в результате стерилизующей фильтрации. Полученные результаты корреляции количества копий РНК с титром нАТ в сыворотках крови мышей линии BALB/c после иммунизации позволяют рассчитать иммунизирующую дозу вакцины по количественному содержанию копий вирусной нуклеиновой кислоты в единице объёма. Согласно данным настоящей работы минимальная иммунизирующая доза инактивированного β-ПЛ вакцинного препарата, индуцирующая нАТ в титре 4,32 log2 у 10 из 10 иммунизированных мышей BALB/c, соответствует 7,5 ± 0,2 × 102 копий РНК/мл. Метод обладает высокой специфичностью и надёжной воспроизводимостью, что делает перспективным его применение для контроля специфической активности вакцин против ГЛПС.

Соблюдение этических стандартов. На момент начала исследования животные находились в одинаковых условиях содержания и кормления. Исследования на экспериментальных моделях проводили в соответствии с международными и национальными положениями по уходу за животными и их использованию. Указанные положения основаны на этических принципах, установленных Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, принятой там же 18 марта 1986 г. и подтверждённой в Страсбурге 1 июня 2006 г. (ETS N 123), (https://www.coe.int/t/e/legal_affairs/legal_cooperation/biological_safety_and_use_of_animals/laboratory_animals/GT123(2002)63%20E%20PART%20B%20Ferrets%20rev2.pdf), соответствующих принципах этического комитета ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова РАН, а также правилах надлежащей лабораторной практики (Good Laboratory Practice, GLP) (http://docs.cntd.ru/document/1200101144, https://www.nc3rs.org.uk/the3rs) (ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики»).

Заключение

Вакцинопрофилактика любого инфекционного заболевания требует адекватного контроля качества вакцинных препаратов. Разработанная система определения количественного содержания вирусной РНК на основе ПЦР-РВ благодаря своим характеристикам представляется перспективной для применения с целью оценки специфической активности вакцины против ГЛПС.

Список литературы

1. Kruger D.H., Figueiredo L.T., Song J.W., Klempa B. Hantaviruses -globally emerging pathogens. J. Clin. Virol. 2014; 64: 128-36. https://doi.org/10.1016/jjcv.2014.08.033.

2. Lahdevirta J. Nephropathia epidemica in Finland. A clinical, histological and epidemiological study. Ann. Clin. Res. 1971; 3(Suppl. 8): 1-154.

3. Schmaljohn C., Hjelle B. Hantaviruses: a global disease problem. Emerg. Infect. Dis. 1997; 3(2): 95-104. https://doi.org/10.3201/eid0302.970202.

4. Maes P., Li S., Verbeeck J., Keyaerts E., Clement J., Van Ranst M. Evaluation of the efficacy of disinfectants against Puumala hantavirus by real-time RT-PCR. J. Virol. Methods. 2007; 141(1): 111-5. https://doi.org/10.1016/jjviromet.2006.11.037.

5. Plyusnin A., Vapalahti O., Vaheri A. Hantaviruses: genome structure, expression and evolution. J. Gen. Virol. 1996; 77(Pt. 11): 2677-87. https://doi.org/10.1099/0022-1317-77-11-2677.

6. Schmaljohn C.S., Dalrymple J.M. Analysis of Hantaan virus RNA: evidence for a new genus of Bunyaviridae. Virology. 1983; 131(2): 482-91. https://doi.org/10.1016/0042-6822(83)90514-7.

7. Tkachenko E.A., Ishmukhametov A.A., Dzagurova T.K., Bern-shtein A.D., Morozov V.G., Sinyugina A.A., et al. Hemorrhagic fever with renal syndrome, Russia. Emerg. Infect. Dis. 2019; 25(12): 2325-8. https://doi.org/10.3201/eid2512.181649.

8. Liu R., Ma H., Shu J., Zhang Q., Han M., Liu Z., et al. Vaccines and therapeutics against hantaviruses. Front. Microbiol. 2019; 10: 2989. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.02989.

9. Бархалева О.А., Воробьева М.С., Ладыженская И.П., Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К. Вакцина против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2011; (1): 27-30.

10. Jiang W., Ma N., Hui Q., Chen B., Qiu Y., Sun H., et al. Type inactivated bivalent hantavirus vaccines using dual fluorescence quantitative real time PCR: Establishment and evaluation. J. Med. Virol. 2017; 89(1): 10-6. https://doi.org/10.1002/jmv.24599.

11. Ткаченко Е.А., Ишмухаметов А.А., Дзагурова Т.К., Синюгина А.А., Коротина Н.А., Набатников П.А., и др. Разработка экспериментально-промышленной технологии производства вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Ремедиум. Журнал о российском рынке лекарств и медицинской технике. 2015; (6): 47-53.

12. Курашова С.С., Ишмухаметов А.А., Егорова MG., Баловнева М.В., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. Сравнительная характеристика инактивирующих агентов для создания вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018; 17(4): 26-8. https://doi.org/10.31631/2073-3046-2018-17-4-26-29.

13. Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. Идентификация и исследование экспрессии генов: Учебно-методическое пособие для вузов. Воронеж; 2008: 14-5.

14. Дзагурова Т.К., Солопова О.Н., Свешников П.Г., Коротина Н.А., Баловнева М.В., Леонович О.А., и др. Разработка иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Вопросы вирусологии. 2013; 58(1): 40-4.

15. Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А., Башкирцев В.Н., Окулова Н.М., Апекина Н.С., Коротина Н.А., и др. Выделение и идентификация штаммов хантавирусов - возбудителей ГЛПС в Европейской части России.Медицинская вирусология. 2008; 25: 142-50.


Об авторах

М. С. Егорова
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Егорова Мария Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок.

108819, Москва



С. С. Курашова
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Курашова Светлана Сергеевна - научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва



А. А. Ишмухаметов
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН; Институт трансляционной медицины и биотехнологии, ФГАОУ ВО Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова Минздрава России
Россия

Ишмухаметов Айдар Айратович - доктор медицинских наук, профессор, член - корреспондент РАН, генеральный директор ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, 119991, Москва



М. В. Баловнева
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Баловнева Мария Владимировна - ведущий научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

119991, Москва



А. А. Девяткин
Институт молекулярной медицины, ФГАОУ ВО Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова Минздрава России
Россия

Девяткин Андрей Андреевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биохимии.

119991, Москва


М. В. Сафонова
ФКУЗ Противочумный центр Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор)
Россия

Сафонова Марина Викторовна - биолог лаборатории диагностики вирусных инфекций I-II групп патогенности.

119121, Москва



С. В. Ожерелков
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Ожерелков Сергей Викторович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клещевого энцефалита и других вирусных энцефалитов ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва



Ю. Х. Хапчаев
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Хапчаев Юсуф Хаджибекович - доктор биологических наук, начальник отделения полиомиелитной вакциныФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва



А. С. Балкина
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Балкина Александра Сергеевна - научный сотрудник лаборатории геморрагических лихорадок ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва



А. В. Белякова
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Белякова Алла Владимировна - кандидат биологических наук, учёный секретарьФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва



Т. К. Дзагурова
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Дзагурова Тамара Казбековна - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник, руководитель Лаборатории геморрагических лихорадок ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва



Е. А. Ткаченко
ФГБНУ Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова, РАН
Россия

Ткаченко Евгений Александрович - доктор медицинских наук, профессор, Руководитель научного направления ФГБНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова РАН.

108819, Москва



Для цитирования:


Егорова М.С., Курашова С.С., Ишмухаметов А.А., Баловнева М.В., Девяткин А.А., Сафонова М.В., Ожерелков С.В., Хапчаев Ю.Х., Балкина А.С., Белякова А.В., Дзагурова Т.К., Ткаченко Е.А. Разработка метода количественного определения вирусной РНК для контроля специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом. Вопросы вирусологии. 2021;66(1):65-73. https://doi.org/10.36233/0507-4088-30

For citation:


Egorova M.S., Kurashova S.S., Ishmukhametov A.A., Balovneva M.V., Deviatkin A.A., Safonova M.V., Ozherelkov S.V., Khapchaev Yu.K., Balkina A.S., Belyakova A.V., Dzagurova T.K., Tkachenko E.A. Real-time PCR assay development for the control of vaccine against hemorrhagic fever with renal syndrome. Problems of Virology. 2021;66(1):65-73. https://doi.org/10.36233/0507-4088-30

Просмотров: 72


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0507-4088 (Print)
ISSN 2411-2097 (Online)