Preview

Вопросы вирусологии

Расширенный поиск

Оценка клеточного иммунитета макаков резусов методом проточной цитометрии после экспериментального инфицирования вирусом Эбола (Filoviridae; Ebolavirus: Zaire ebolavirus)

https://doi.org/10.36233/0507-4088-64

Полный текст:

Аннотация

Введение. Возникающие в последнее десятилетие вспышки болезни, вызываемой вирусом Эбола (ВЭ) (БВВЭ), определяют необходимость изучения патогенеза этой нозологической формы, формирования специфического иммунитета, а также создания эффективных средств профилактики и лечения. Все звенья борьбы с распространением заболевания невозможны без экспериментального моделирования инфекции на чувствительных к ней лабораторных животных, которыми для БВВЭ являются макаки резусы.

Цель исследования – оценка клеточного иммунитета макаков резусов методом проточной цитометрии (цитофлуориметрии) (ПЦ) после экспериментального инфицирования ВЭ.

Материал и методы. Самцов макаков резусов внутримышечно инфицировали ВЭ, штамм Заир, в дозе 15 LD50 (доза возбудителя, вызывающая гибель 50% инфицированных животных). С использованием метода ПЦ определены уровни 18 популяций/субпопуляций лимфоцитов периферической крови животных до экспериментального инфицирования возбудителем и в терминальной стадии заболевания.

Результаты и обсуждение. Выявлено достоверное изменение после инфицирования уровня популяций/ субпопуляций лимфоцитов, указывающее на сочетание активации и супрессии иммунной системы при БВВЭ. Увеличение содержания отмечено для Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессирующих соответствующие маркёры ранней активации. Снижение количества показано для Т-лимфоцитов и дубль-позитивных Т-лимфоцитов с экспрессией соответствующих маркёров поздней активации, а также натуральных киллеров, экспрессирующих CD8 (статистическая значимость оценивалась величиной р < 0,05).

Заключение. Впервые в Российской Федерации методом ПЦ проведено сравнение характеристик клеточного иммунитета макаков резусов до и после экспериментального инфицирования ВЭ. Информация по динамике изменений популяций лимфоцитов может иметь диагностическую значимость в ходе изучения патологического процесса при инфицировании данным возбудителем, контроле эффективности терапии, прогнозе возникновения и течения заболевания, а также его исхода.

Для цитирования:


Борисевич Г.В., Кириллова С.Л., Шатохина И.В., Лебедев В.Н., Шагарова Н.В., Сыромятникова С.И., Андрус А.Ф., Ковальчук Е.А., Кириллов В.Б., Беспалов М.Л., Петров А.А., Ковальчук А.В., Пантюхов В.Б., Кутаев Д.А., Борисевич С.В., Кузнецов С.Л. Оценка клеточного иммунитета макаков резусов методом проточной цитометрии после экспериментального инфицирования вирусом Эбола (Filoviridae; Ebolavirus: Zaire ebolavirus). Вопросы вирусологии. 2021;66(4):289-298. https://doi.org/10.36233/0507-4088-64

For citation:


Borisevich G.V., Kirillova S.L., Shatokhina I.V., Lebedev V.N., Shagarova N.V., Syromyatnikova S.I., Andrus A.F., Koval’chuk E.A., Kirillov V.B., Bespalov M.L., Petrov A.A., Koval’chuk A.V., Pantyukhov V.B., Kutayev D.A., Borisevich S.V., Kuznetsov S.L. Flow cytometry evaluation of the rhesus monkey cellular immunity following the Zaire ebolavirus (Filoviridae; Ebolavirus: Zaire ebolavirus) experimental infection. Problems of Virology. 2021;66(4):289-298. (In Russ.) https://doi.org/10.36233/0507-4088-64

Введение

Вспышки болезни, вызываемой вирусом Эбола (ВЭ) (Filoviridae; Ebolavirus: Zaire ebolavirus) (БВВЭ), возникающие в последнее десятилетие [1], определяют необходимость изучения патогенеза данной нозологической формы, формирования специфического иммунитета, а также разработки действенных средств профилактики и лечения [2]. Одно из перспективных направлений в современной инфекционной иммунологии – определение роли наиболее значимых поверхностных антигенов, экспрессируемых на иммунокомпетентных клетках, в реализации иммунного ответа при инфекционных заболеваниях [3]. К настоящему времени доказано, что именно клеточный иммунитет играет ключевую роль в патогенезе БВВЭ и формировании протективной иммунной защиты по отношению к ВЭ [4–7]. Для создания эффективных медицинских средств необходимым этапом является экспериментальное моделирование инфекции на чувствительных к ней лабораторных животных, которыми для БВВЭ являются низшие приматы (Primates: Strepsirrhini), в т.ч. макаки резусы (Macaca mulatta, Macaca rhesus). [8]. В связи с этим оценка клеточного иммунитета представителей этого вида с использованием метода проточной цитометрии (ПЦ) после экспериментального инфицирования ВЭ представляет собой в настоящее время актуальную задачу.

В процессе изучения характеристик Т-клеточного иммунного ответа на внедрение инфекционного агента у человека в дополнение к оценке основных популяций лимфоцитов [9] определяется также экспрессия маркёров ранней (CD25) и поздней активации (антигены главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) II класса HLA-DR) на субпопуляциях Т-лимфоцитов [10]. При исследовании крови инфицированных ВЭ обезьян ввиду схожести кроветворной и иммунной систем человека и макака резуса [11], а также с учётом возможностей приборно-реагентной базы можно придерживаться этого же перечня.

Целью настоящей работы являлась оценка методом (ПЦ) клеточного иммунитета макаков резусов после экспериментального инфицирования ВЭ.

Материал и методы

Животные. В опытах использовали 6 здоровых самцов макаков резусов в возрасте 2,0–2,5 года массой 2,5–3,0 кг, доставленных из питомника Адлерского приматологического центра (г. Сочи) и прошедших месячную акклиматизацию с ежедневным измерением ректальной температуры, осмотром кожных покровов и слизистых оболочек. Эксперименты на животных проводили в соответствии с ГОСТ 33218- 2014 (Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за нечеловекообразными приматами) и Федеральным законом РФ «Об ответственном обращении с животными» (N 498-ФЗ от 27.12.2018).

Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с «Consensus Author Guidelines for Animal Use» (IAVES, 23 July 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (Протокол № 2 от 29.05.2020 г.).

Вирус. Культура ВЭ, штамм Заир, прошедшего 4 пассажа через печень павианов гамадрилов (Papio hamadryas), с биологической активностью 2,1 × 105 lg БОЕ/мл (БОЕ – бляшкообразующая единица), 3,0 × 107 LD50/мл (LD50 – доза возбудителя, вызывающая гибель 50% инфицированных животных), получена из Специализированной коллекции эталонных культур штаммов вирусов – возбудителей геморрагических лихорадок I группы патогенности, депонированной в коллекции ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России. Работы с вирусом проводили в соответствии с требованиями Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)».

Обезьян инфицировали внутримышечно в дозе 15 LD50. Для сбора образцов крови животных анестезировали путём внутримышечного введения золетила (тилетамина гидрохлорид и золазепама гидрохлорид) из расчёта 4–6 мг препарата на 1 кг массы тела. Биологическую активность возбудителя в пробах крови определяли титрованием на культуре клеток GMK-АН-1(Д) по методу негативных колоний [12].

После введения инфекционного агента, начиная с 3–5 сут, у обезьян развивалась типичная картина БВВЭ, проявлявшаяся геморрагической сыпью, кровотечениями, отказом от пищи, снижением двигательной активности. Гибель наступала на 7–10 сут после инфицирования.

Проточно-цитометрический анализ

С целью выявления популяций лимфоцитов периферической крови обезьян применяли 3 панели конъюгированных с флуорохромами мышиных античеловеческих моноклональных антител (МКАТ), перекрёстно реагирующих с антигенами лимфоцитов макаков резусов: CD16-FITC/CD19-PE/CD3-PE-Cy7, CD25-FITC/CD4-PE/HLA-DR-ECD/CD8-PC5/ CD3-PE-Cy7 и CD25-FITC/CD4-PE/CD127-PE-Cy5/CD3-PE-Cy7.

Поскольку процедура иммунофенотипирования лимфоцитов обезьян идентична используемой для человека [13], составление цитометрических панелей и настраивание протоколов анализа проводили в соответствии со стандартизованной технологией [14] и принципами формирования панелей для многоцветных цитофлуориметрических исследований [15].

Использовали следующие МКАТ, входящие в состав цитометрических панелей: Affymetrix eBioscience («ThermoFisher Scientific», США) (CD25-FITC, кат. № 11-0257; CD4-PE, кат. № 12-0048; CD127- PE-Cy5, кат. № 15-1278); Beckman Coulter (США) (CD8-PC5, кат. № A07758; HLA-DR-ECD, кат. № IM3636); Becton Dickinson (CША) (CD3-PE-Cy7, кат. № 557749); Novus (США) (CD19-PE, кат. № 6602868); Serotec (США) (CD16-FITC, кат. № МСА1569F). Рабочие объёмы МКАТ определяли путём титрования, рассчитывая для каждого разведения индекс окрашивания (stain index) [16]. При использовании антител против маркёров CD25, CD127 и HLA-DR для настраивания протоколов анализа применяли соответствующие изотипические контроли Affymetrix eBioscience (IgG2b-FITC, кат. № 11-4732; IgG1-PE-Cy5, кат. № 15- 4714) и Beckman Coulter (IgG1-ЕСD, кат. № А07797). Корректность компенсации проверяли с использованием FMO-подхода (Fluorescence-Мinus-Оne, флуоресценция минус один) [17].

Для проточно-цитометрического анализа забор крови у животных проводили в «чистой» зоне за 1 сут до инфицирования (с целью определения фоновых показателей) и в «заразной» зоне при заключительной (терминальной) стадии заболевания. Из пробирки с калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (К3-ЭДТА) отбирали по 50 мкл крови в 3 цитометрические пробирки с предварительно внесёнными антителами. После 15-минутной инкубации в темноте при комнатной температуре (18–24 °C) для лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов в пробирки вносили реагент OptiLyse С («Beckman Coulter»), кат. № 11895, в объёме 250 мкл. Входящий в состав реагента формальдегид (CH2 O) (1,5%) обеспечивал инактивацию вируссодержащего материала. Реакционную смесь повторно инкубировали в темноте при комнатной температуре 15 мин, затем добавляли 250 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Концентрация формальдегида в пробе на этой стадии составляла 0,75%. Каждый этап внесения реагентов в пробирки сопровождали перемешиванием на лабораторной мешалке типа вортекс в течение 1 с. После добавления буфера пробирки на 1 ч помещали в передаточный шлюз для обработки аэрозолем 10% пероксида водорода (H2O2) из расчёта 10 мл на 1 мобъëма камеры в целях безопасной передачи из «заразной» зоны в «чистую». Далее образцы дважды отмывали в PBS, центрифугируя по 5 мин при 400 g, после чего клетки ресуспендировали для анализа в 200 мкл фиксирующего буфера, содержащего 0,1% формальдегида. Иммунофенотипирование осуществляли на цитофлуориметре Cytomics FC 500 («Beckman Coulter»), оснащённом аргоновым лазером с длиной волны излучения 488 нм с программным обеспечением СХР, версия 2.3. В каждой пробе анализировали не менее 10 000 лимфоцитов.

Показатели анализировали с использованием порядковых (непараметрических) статистических методов – критерия знаков и критерия Уайта средствами Microsoft Office Excel 2016. За уровень статистической значимости принимали величину р < 0,05 [18].

Результаты

Поскольку в ряде случаев изменения уровней основных популяций лимфоцитов оказываются недостаточно информативными, дополнительно были исследованы малые популяции/субпопуляции лимфоцитов и пулы активированных клеток [10]. С использованием 3 цитометрических панелей определены уровни 18 популяций лимфоцитов периферической крови (в процентном выражении для соответствующих популяций/субпопуляций) у 6 макаков резусов до экспериментального инфицирования ВЭ и в терминальной стадии заболевания. Средние значения (Хср) содержания лимфоцитов для каждого животного до и после инфицирования рассчитаны по результатам 3 измерений (табл. 1).

Таблица 1. Средние значения уровней лимфоцитов до и после экспериментального инфицирования обезьян вирусом Эбола
Table 1. Average values of the lymphocytes counts before and after the experimental infection of monkeys with Zaire ebolavirus



Примечание
. ⃰ Средние значения (Хср) уровня лимфоцитов для каждого животного до и после инфицирования рассчитывали по результатам 3 измерений. Данные представлены в виде процентов от общего количества: 1 – лимфоцитов, 2 − Т-лимфоцитов, 3 – Т-хелперов, 4 − цито- токсических Т-лимфоцитов, 5 – дубль-позитивных Т-лимфоцитов, 6 − дубль-негативных Т-лимфоцитов; БОЕ – бляшкообразующая единица.
Note. *Average values (Хаverage) of the lymphocytes counts before and after the infection calculated after three measurement results for every animal. Data are shown as percentage of the total amount: 1, lymphocytes; 2, T-lymphocytes; 3, T-helpers; 4, cytotoxic T-lymphocytes; 5, double-positive T-lymphocytes; 6, double-negative T-lymphocytes; PFU, plaque-forming units.

Значительная вариабельность исследуемых показателей и малочисленность выборки не позволили использовать методы параметрической статистики, поэтому статистическую обработку результатов эксперимента провели с использованием порядковых (непараметрических) статистических методов – критерия знаков и критерия Уайта (табл. 2) [18].

Таблица 2. Статистические характеристики уровня лимфоцитов макаков резусов до и после экспериментального инфицирования вирусом Эбола
Table 2. Statistical characteristics of lymphocytes level of the rhesus monkeys before and after the Zaire ebolavirus experimental infection


Примечание
. *Средние значения (Хср) уровней лимфоцитов для каждого животного до и после инфицирования рассчитывали по результатам 3 измерений. Данные представлены в виде процентов от общего количества: 1 – лимфоцитов, 2 − Т-лимфоцитов, 3 – Т-хелперов, 4 − цитоток- сических Т-лимфоцитов, 5 – дубль-позитивных Т-лимфоцитов, 6 − дубль-негативных Т-лимфоцитов;
**↑ или ↓ – рост или снижение значения показателя после инфицирования; «–» – отсутствие различий между значениями показателя до и после инфицирования.
Note. *Average measures (Xaverage) of the lymphocytes levels before and after the infection calculated after three measurement results for every animal. Data are shown as percentage of the total amount: 1, lymphocytes; 2, T-lymphocytes; 3, T-helpers; 4, cytotoxic T-lymphocytes; 5, double-positive T-lymphocytes; 6, double-negative T-lymphocytes;
**↑, or ↓ mean the increase or decrease of the index value following the infection; «–» means the absence of differences between the index values before and after the infection.

У каждого из 6 животных (№№ 1–6) после инфицирования выявлено уменьшение уровней следующих популяций/субпопуляций:

  • Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркёр поздней активации;
  • Т-хелперов, экспрессирующих маркёр поздней активации;
  • дубль-позитивных Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркёр поздней активации;
  • натуральных киллеров (NK), экспрессирующих CD8.

В противоположность этому отмечено повышение содержания:

  • Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркёр ранней активации;
  • Т-хелперов, экспрессирующих маркёр ранней активации;
  • дубль-негативных Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркёр ранней активации;
  • цитотоксических лимфоцитов, экспрессирующих маркёр ранней активации.

В соответствии с критерием знаков можно считать достоверным влияние инфицирования на изменение (рост или уменьшение) значений перечисленных показателей (р < 0,05).

Использование критерия Уайта выявило достоверное снижение средних значений уровней Т-лимфоцитов и дубль-позитивных Т-лимфоцитов, экспрессирующих соответствующие маркёры поздней активации. Выявлен достоверный рост уровня Т-лимфоцитов, Т-хелперов и цитотоксических лимфоцитов с экспрессией соответствующих маркёров ранней активации.

Для 5 популяций лимфоцитов выявлены достоверные различия как по критерию знаков, так и по критерию Уайта. К ним относятся:

  • Т-лимфоциты, экспрессирующие маркёр ранней активации;
  • Т-хелперы, экспрессирующие маркёр ранней активации;
  • цитотоксические лимфоциты, экспрессирующие маркёр ранней активации;
  • Т-лимфоциты, экспрессирующие маркёр поздней активации;
  • дубль-позитивные Т-лимфоциты, экспрессирующие маркёр поздней активации (р < 0,05).

Указанный факт свидетельствует о выраженном количественном изменении показателей иммунного статуса моделей в результате инфицирования.

Обсуждение

В настоящее время ввиду отсутствия условий для проведения исследований при соответствующем уровне биологической защиты количество доступных публикаций, отражающих иммунный ответ на введение ВЭ (в особенности с применением метода ПЦ), весьма ограничено.

Высокий показатель летальности при БВВЭ указывает на то, что иммунная система во многих случаях не может подавлять репликацию возбудителя. При изучении экспериментально вызванной ВЭ инфекции у яванских макаков (Macaca fascicularis) выявлен массовый лимфоцитарный апоптоз, проявляющийся снижением экспрессии маркёров CD4 и CD8 и увеличением экспрессии апоптотического фактора CD95 на Т-клетках. Также отмечено уменьшение популяции CD8low-лимфоцитов, состоящих в основном из NK-клеток. В то же время количество CD20+ В-лимфоцитов за время болезни существенно не изменялось [19].

Пациенты, погибшие во время вспышки БВВЭ (штамм Судан) в Уганде в 2000 г., имели сниженный уровень общих (common) Т-лимфоцитов, а также CD8+и активированных (HLA-DR+)CD8+ популяций Т-клеток, в то время как у переживших заболевание отмечены обратные показатели [20].

В результате изучения коллекции из 56 образцов крови 42 умерших и 14 выживших больных БВВЭ, полученной во время 5 вспышек, произошедших с 1996 по 2003 г. в Габоне и Республике Конго, обнаружено, что летальный исход связан с аберрантными врождёнными иммунными ответами и с глобальным подавлением адаптивного иммунитета. Отклонения во врождëнном иммунитете характеризовались цитокиновым штормом, гиперсекрецией многочисленных провоспалительных медиаторов и характерным отсутствием противовирусного интерферона IFNα2. Иммуносупрессия заключалась в наличии крайне низких уровней продуцируемых Т-лимфоцитами циркулирующих цитокинов и массивной потере периферических CD4+ и CD8+ лимфоцитов, вероятно, через Fas/FasL-опосредованный апоптоз, который проявлялся увеличением экспрессии апоптотического фактора CD95 на Т-клетках [4].

Далее, исследования клеточного и гуморального иммунного ответа 4 человек с установленным диагнозом БВВЭ, проходивших лечение в госпитале при Университете Эмори (Атланта, Соединённые Штаты Америки (США)), выявили повышенное количество плазмобластов и активированных CD4+ и CD8+ Т-клеток у всех пациентов по сравнению с неинфицированным контингентом (30–60% CD8+ Т-лимфоцитов экспрессировали маркёры активации CD38 и HLA DR). На основании полученных данных сформулированы две модели, объясняющие неспособность иммунной системы контролировать ВЭ (EBOV) при летальных инфекциях. Модель 1 (EBOV-супрессия) отражает значительное подавление иммунных реакций в результате инфицирования, что предотвращает развитие эффективного иммунного ответа макроорганизма. Сущностью модели 2 является предположение о том, что ключевыми для исхода инфекции являются время и кинетика репликации возбудителя и иммунного ответа, поскольку последний, будучи поздним или незавершившимся, не способен подавлять репликационный процесс, что ведёт к летальному исходу. Напротив, ранний иммунный ответ уменьшает репликацию патогена и приводит к выздоровлению [21].

Опубликован отчёт об изучении методом ПЦ динамики содержания лимфоцитов у выжившего после БВВЭ пациента, получавшего только поддерживающую терапию. Образцы крови были отобраны на 37 и 46 сут после болезни. Доля активированных (CD8+CD38+HLADR+) Т-клеток составила 68%, что существенно превышало аналогичные показатели контрольной группы, которые колебались в пределах 4–12%. Популяция регуляторных Т-клеток (CD4+CD25hiCD127low) была количественно сопоставима с таковой в контрольной группы. Таким образом, активация системы иммунитета способствовала подавлению репликации возбудителя и выздоровлению [5].

В исследованиях NK- и γδ2Т-клеток у 19 пациентов с БВВЭ независимо от клинического исхода зафиксировано низкое содержание последних, которые массово экспрессировали маркёр апоптоза CD95. У пациентов с фатальной инфекцией отмечена меньшая доля NK-клеток по сравнению с выжившими [22].

Полученные в нашей работе результаты по анализу клеточного иммунитета макаков резусов после экспериментального инфицирования ВЭ, представленные в табл. 1 и 2, практически полностью согласуются с опубликованными ранее сведениями и подтверждают сочетание активации и супрессии иммунной системы при БВВЭ [21]. Достоверное повышение в большинстве субпопуляций Т-лимфоцитов экспрессии CD25 свидетельствует об активации системы иммунитета при воздействии ВЭ (EBOV). Увеличение у 5 из 6 особей уровня Т-регуляторных клеток также указывает на иммунологическую гиперактивность. Зарегистрировано повышение содержания активированных цитотоксических лимфоцитов в 9 раз (против 2 раз для Т-хелперов), что подтверждает ведущую роль CD3+CD8+- лимфоцитов в противовирусном ответе [7].

Подтверждённые в выполненных экспериментах значимое уменьшение популяции экспрессирующих CD8 NK-клеток, обладающих литическими функциями [23], а также снижение популяции натуральных киллеров у всех обезьян, кроме одной, указывает на подавление реакции врождённого иммунитета. Результаты опытов позволяют также сделать вывод об иммуносупрессивном действии ВЭ, поскольку у 4 из 6 приматов произошло сокращение популяций Т- и В-лимфоцитов, а также Т-хелперов; кроме того, достоверно уменьшились популяции/субпопуляции лимфоцитов, экспрессирующих маркёры поздней активации.

Заключение

В данной работе впервые в Российской Федерации проведена оценка клеточного иммунитета макаков резусов методом ПЦ после экспериментального инфицирования ВЭ. Полученная информация по динамике изменений популяций и субпопуляций лимфоцитов может быть диагностически значимой при изучении патологического процесса при инфицировании вирусом Эбола, контроле эффективности терапии, прогнозе возникновения, течения и исхода заболевания.

Список литературы

1. WHO. Ebola virus disease Democratic Republic of Congo: external situation report 98/ 2020. Available at: https://www.who.int/publications/i/item/10665-332654 (accessed 16 August 2021).

2. Cenciarelli O., Gabbarini V., Pietropaoli S., Maliziaa A., Tamburrinic A., Ludovicic G.M., et al. Viral bioterrorism: learning the lesson of Ebola virus in West Africa 2013–2015. Virus. Res. 2015; 210(12): 318–26. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2015.09.002

3. Wieland E., Shipkova M. Lymphocyte surface molecules as immune activation biomarkers. Clin. Biochem. 2016; 49(4-5): 347–54. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2015.07.099

4. Wauquier N., Becquart P., Padilla C., Baize S., Leroy E.M. Human fatal Zaire Ebola virus infection is associated with an aberrant innate immunity and with massive lymphocyte apoptosis. PLoS Negl. Trop. Dis. 2010; 4(10): e837. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0000837

5. Dahlke C., Lunemann S., Kasonta R., Kreuels B., Schmiedel S., Ly M.L., et al. Comprehensive characterization of cellular immune responses following Ebola virus infection. J. Infect. Dis. 2017; 215(2): 287–92. https://doi.org/10.1093/infdis/jiw508

6. Wilson J.A., Hart M.K. Protection from Ebola virus mediated by cytotoxic T lymphocytes specific for the viral nucleoprotein. J. Virol. 2001; 75(6): 2660–4. https://doi.org/10.1128/JVI.75.6.2660-2664.2001

7. Warfield K.L., Olinger G.G. Protective role of cytotoxic T lymphocytes in filovirus hemorrhagic fever. J. Biomed. Biotechnol. 2011; 2011: 984241. https://doi.org/10.1155/2011/984241e

8. Bente D., Gren J., Strong J.E., Feldmann H. Disease modeling for Ebola and Marburg viruses. Dis. Model. Mech. 2009; 2(1-2): 12–7. https://doi.org/10.1242/dmm.000471

9. Хаитов Р.М. Иммунология: структура и функции иммунной системы: учебное пособие. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2019.

10. Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Тотолян А.А., Черешнев В.А. Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения (методом многоцветного цитометрического анализа). Медицинская иммунология. 2009; 11(2-3): 227–38. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2009-2-3-227-238.

11. Лапин Б.А. К вопросу об использовании в медицинских экспериментах лабораторных приматов. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2010; (2): 3–6.

12. Пшеничнов В.А., Махлай А.А., Михайлов В.В. Исследования с вирусами Марбург, Ласса и Эбола. Вопросы вирусологии. 1993; 38(2): 54–9.

13. Sestak K., Scheiners C., Wu X.W., Hollemweguer E. Identification of anti-human CD antibodies reactive with rhesus macaque peripheral blood cells. Vet. Immunol. Immunopathol. 2007; 119(1-2): 21–6. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2007.06.011

14. Хайдуков С.В., Байдун Л.В., Зурочка А.В., Тотолян А.А. Стандартизованная технология «Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с применением проточных цитофлюориметров-анализаторов». Российский иммунологический журнал. 2014; (4): 974–92. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2012-3-255-268

15. Кудрявцев И.В., Субботовская А.И. Опыт измерения параметров иммунного статуса с использованием шестицветного цитофлуоримерического анализа. Медицинская иммунология. 2015; 17(1): 19–26. https://doi.org/0.15789/1563-0625-2015-1-19-26

16. Telford W.G., Babin S.A., Khorev S.V., Rowe S.H. Green fiber lasers: an alternative to traditional DPSS green lasers for flow cytometry. Cytometry A. 2009; 75(12): 1031–9. https://doi.org/10.1002/cyto.a.20790

17. Hammerbeck C., Goetz C., Bonnevier J. Primary and secondary antibodies and flow cytometry controls. In: Flow Cytometry Basics for the Non-Expert. Cham: Springer; 2018: 75–103. https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-319-98071-3_6

18. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие. М.: Высшая школа; 1990.

19. Reed D.S., Hensley L.E., Geisbert J.B., Jahrling P.B., Geisbert T.W. Depletion of Peripheral Blood T Lymphocytes and NK Cells During the Course of Ebola Hemorrhagic Fever in Cynomolgus Macaques. Viral. Immunol. 2004; 17(3): 390–400. https://doi.org/10.1089/vim.2004.17.390

20. Sanchez A., Lukwiya M., Bausch D., Mahanty S., Sanchez A.J., Wagoner K.D., et al. Analysis of human peripheral blood samples from fatal and nonfatal cases of Ebola (Sudan) hemorrhagic fever: cellular responses, virus load, and nitric oxide levels. J. Virol. 2004; 78(190): 10370–7. https://doi.org/10.1128/JVI.78.19.10370-10377.2004

21. McElroya A.K., Akondyc R.S., Davisc C.W., Ellebedyc A.H., Mehtae A.K., Krafte C.S., et al. Human Ebola virus infection results in substantial immune activation. PNAS. 2015; 112(15): 4719–24. https://doi.org/10.1073/pnas.1502619112

22. Cimini E.С., Viola D., Cabeza-Cabrerizo M., Romanelli А., Tumino N., Sacchi A., et al. Different features of Vδ2 T and NK cells in fatal and non-fatal human Ebola infections. PLoS Trop. Dis. 2017; 11(5): e0005645. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0005645

23. Addison E.G., North J., Bakhsh I., Marden C., Haq S., Al-Sarraj S., et al. Ligation of CD8alpha on human natural killer cells prevents activation-induced apoptosis and enhances cytolytic activity. Immunology. 2005; 116(3): 354–61. https://doi.org/10.1111/j.1365-2567.2005.02235.x


Об авторах

Г. В. Борисевич
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

Борисевич Галина Валентиновна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела

141306, Сергиев Посад-6, Россия



С. Л. Кириллова
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



И. В. Шатохина
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



В. Н. Лебедев
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



Н. В. Шагарова
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



С. И. Сыромятникова
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



А. Ф. Андрус
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



Е. А. Ковальчук
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



В. Б. Кириллов
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



М. Л. Беспалов
ООО «МедисКоМ»
Россия

127254, Москва, Россия



А. А. Петров
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



А. В. Ковальчук
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



В. Б. Пантюхов
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



Д. А. Кутаев
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



С. В. Борисевич
ФГБУ «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации
Россия

141306, Сергиев Посад-6, Россия



С. Л. Кузнецов
Управление начальника войск радиационной, химической и биологической защиты Вооружённых Сил Министерства обороны Российской Федерации
Россия

119160, Москва, Россия



Для цитирования:


Борисевич Г.В., Кириллова С.Л., Шатохина И.В., Лебедев В.Н., Шагарова Н.В., Сыромятникова С.И., Андрус А.Ф., Ковальчук Е.А., Кириллов В.Б., Беспалов М.Л., Петров А.А., Ковальчук А.В., Пантюхов В.Б., Кутаев Д.А., Борисевич С.В., Кузнецов С.Л. Оценка клеточного иммунитета макаков резусов методом проточной цитометрии после экспериментального инфицирования вирусом Эбола (Filoviridae; Ebolavirus: Zaire ebolavirus). Вопросы вирусологии. 2021;66(4):289-298. https://doi.org/10.36233/0507-4088-64

For citation:


Borisevich G.V., Kirillova S.L., Shatokhina I.V., Lebedev V.N., Shagarova N.V., Syromyatnikova S.I., Andrus A.F., Koval’chuk E.A., Kirillov V.B., Bespalov M.L., Petrov A.A., Koval’chuk A.V., Pantyukhov V.B., Kutayev D.A., Borisevich S.V., Kuznetsov S.L. Flow cytometry evaluation of the rhesus monkey cellular immunity following the Zaire ebolavirus (Filoviridae; Ebolavirus: Zaire ebolavirus) experimental infection. Problems of Virology. 2021;66(4):289-298. (In Russ.) https://doi.org/10.36233/0507-4088-64

Просмотров: 135


Creative Commons License
Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.


ISSN 0507-4088 (Print)
ISSN 2411-2097 (Online)